焦磷酸测序技术检测隐孢子虫的方法

摘要

本发明公开了一种焦磷酸测序技术检测隐孢子虫的方法，先依据隐孢子虫18S rRNA设计特异性引物及焦磷酸测序引物；再提取待测样品的脱氧核糖核酸(DNA)，然后分别以18SrRNA基因的特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增；用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，若引物扩增片段长度为201bp，则制备焦磷酸测序单链模板，再进行焦磷酸测序反应，最后根据PCR扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有贾第鞭毛虫。本发明适用于对隐孢子虫进行快速检测确证，可广泛应用于环境中的水质监控、人体粪便中卵囊检测及进出口贸易中该类原虫的确证，操作极为简便，所需样品量小。

主权项

一种焦磷酸测序技术检测隐孢子虫的非诊断方法，其特征在于，首先依据隐孢子虫18SrRNA设计特异性引物及焦磷酸测序引物；再提取待测样品的脱氧核糖核酸（DNA），然后分别以18S rRNA基因的特异性引物进行聚合酶链式反应（PCR）扩增；用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，若引物扩增片段长度为201bp，则制备焦磷酸测序单链模板，再进行焦磷酸测序反应，最后根据PCR扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有隐孢子虫；PCR反应为阳性的，进行焦磷酸测序分析，测序片段与18S rRNA基因目标片段完全相同的，确定为隐孢子虫；PCR反应为阳性的，测序片段与目标片段有一个以上碱基不同判定为非隐孢子虫；PCR反应为阴性的判定为非隐孢子虫；所述的设计隐孢子虫的特异性引物及焦磷酸测序引物是根据该虫的18S rRNA基因序列，选取保守序列，通过Assay Design SW软件设计特异性引物序列，以扩增出特异性单一条带，再根据扩增区域中包含的特异核苷酸序列设计焦磷酸测序引物以确证是否为隐孢子虫；隐孢子虫PCR及测序引物为：18S rRNA基因上游引物5’‑CTTGAATACTCCAGCATGGAATAA‑3’，5’进行生物素标记18S rRNA基因下游引物5’‑TCCCCTAACTTTCGTTCTTGATT‑3’，18S rRNA基因测序引物5’‑ATACAAATGCCCCCA‑3’；隐孢子虫18S rRNA基因的目标序列：ACTGTCCCTA TTAATCATTA TTCTT；扩增片段长度为201bp。