| 主权项 |
一种鱼糜制品中肉来源的检测方法，其特征在于：步骤一、DNA提取：用灭菌后的剪刀将鱼糜制品剪碎，称取1g鱼糜制品于15mL灭菌的离心管中，加入4mL的TE抽提液，匀浆；加入400µL10% SDS和80µL 20mg/ml蛋白酶K充分混匀；将离心管置于65℃的恒温水浴槽中孵育，直至混合液消化至澄清为止；12000r/min 离心30min，取上清液至新的离心管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇=25:24:1，缓慢颠倒混匀，12000 r/min 离心10min；取上清液至新的离心管中，加入2倍体积‑20℃预冷的无水乙醇，上下颠倒数次，12000 r/min 离心10min；弃去乙醇，吹干，获得DNA；然后加入100µL超纯水溶解, 使用超微量核酸蛋白质测定仪，将DNA浓度稀释至100ng/µL左右作为模板；步骤二、多重PCR：多重PCR扩增采用50μL的体系，DNA模板1μL，含Mg2+的10×PCR缓冲液 5μL，浓度为2.5mmol/L dNTPs mixture 2μL，鸡肉特征引物Gg‑F和Gg‑R：鸭肉特征引物Ap‑F和Ap‑R：猪肉特征引物Ss‑F和Ss‑R=2:1:1，所需的引物浓度均为10μmol/L，5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL，加超纯水补充至50μL；PCR扩增反应程序分为两部分，第一部分：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火40s，72℃延伸50s；以后每个循环依次降低0.5℃，直到52.5℃，共25个循环；进入第二部分，94℃变性30s，52℃退火40s，72℃延伸50s，12个循环；最后72℃延伸8min；步骤三、电泳检测：取5μL PCR产物与1μL 预染液混合，预染2‑3min，于1.0%的琼脂糖凝胶上进行点样, 120V条件下电泳30min，然后，采用凝胶成像系统拍照；步骤四、结果鉴定：观察电泳结果，鸡肉、鸭肉和猪肉对应的扩增片段大小分别为187bp、333bp和515bp，如有上述大小的片段，则认为结果为阳性，样品中含用相对应的肉类成分，如无上述大小片段，则认为是阴性，样品中不含有鸡肉、鸭肉和猪肉；所述引物的序列：鸡肉特征引物Gg‑F：AGCAGGTGTTTCCTCCAT 和Gg‑R：GTTGCGGTCGGTAAGTAG，扩增片段187bp；鸭肉特征引物Ap‑F：CATTCCTCCTTATACTCGC和Ap‑R：ATGTGGTGTTTAGGTTTCG，扩增片段333bp；猪肉特征引物Ss‑F：AACCCTACTTGGCGATGA和Ss‑R：GTGTTCAGGTTGCGGTCT，扩增片段515bp。 |
