一种丹参素的生物生产方法

摘要

本发明公开了一种丹参素的生物生产方法，对羟基苯丙酮酸在对羟基苯乙酸间位羟基化酶的催化下合成3，4-二羟基苯丙酮酸，随后在D-乳酸脱氢酶的催化下合成丹参素；或者对羟基苯丙酮酸现在D-乳酸脱氢酶的催化下合成对羟基苯乳酸，然后在经过对羟基苯乙酸间位羟基化酶的催化，合成丹参素。本发明使用基因工程谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌，进行发酵生产丹参素，不需底物添加即可合成丹参素，实现了丹参素的从头合成，可解决丹参素的来源问题，同时最大限度的降低了生产成本，有利于工业化生产。

主权项

一种丹参素的生物生产方法，其特征在于，按照下述步骤进行：步骤1，设计并优化对羟基苯乙酸间位羟基化酶的基因序列，并全合成所述目标基因；所述对羟基苯乙酸间位羟基化酶的基因序列如序列表SEQ ID No.1所示；步骤2，设计并优化D‑乳酸脱氢酶（D‑LCH）的基因序列，并全合成所述目标基因，并经过位点突变，获得D‑乳酸脱氢酶基因序列的突变基因序列D‑LCH（Y52V）和D‑LCH（Y52A）；所述D‑乳酸脱氢酶（D‑LCH）的基因序列如序列表SEQ ID No.4所示，其对应的蛋白质序列中第52位氨基酸为酪氨酸；所述D‑乳酸脱氢酶基因序列的突变基因序列D‑LCH（Y52V）如序列表SEQ ID NO.7所示，其对应的蛋白序列如序列表SEQ ID NO.8所示，与序列表SEQ ID No.4编码的蛋白质相比，在第52位氨基酸突变为缬氨酸；所述D‑乳酸脱氢酶基因序列的突变基因序列D‑LCH（Y52A）如序列表SEQ ID NO.9所示，其对应的蛋白序列如序列表SEQ ID NO.10所示，与序列表SEQ ID No.4编码的蛋白质相比，在第52位氨基酸突变为丙氨酸；步骤3，设计并优化T7RNA聚合酶基因序列，并全合成所述目标基因；所述T7RNA聚合酶基因序列如序列表SEQ ID NO.15所示，RNA聚合酶蛋白序列如序列表SEQ ID NO.16所示；步骤4，将获得的对羟基苯乙酸间位羟基化酶基因序列SEQ ID No.1、T7RNA聚合酶基因序列SEQ ID NO.15，与D‑乳酸脱氢酶基因序列SEQ ID No.4、D‑乳酸脱氢酶基因序列的突变基因序列D‑LCH（Y52V）SEQ ID NO.7、或者D‑乳酸脱氢酶基因序列的突变基因序列D‑LCH（Y52A）SEQ ID NO.9之一的序列进行配合构建表达载体，并转染大肠杆菌或者嵌入大肠杆菌基因组；所述大肠杆菌为高产酪氨酸大肠杆菌，菌种名称为SyBE‑002447，建议的分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，现于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.7962；步骤5，利用步骤4得到的工程菌进行发酵生产丹参素。