一种用于天然蛋白分子分离鉴定的梯度电泳方法

摘要

一种用于天然蛋白分子分离鉴定的梯度电泳方法，包括配置梯度胶、制备凝胶板、上样、电泳、凝胶经染色、脱色及成像等步骤，本发明建立的Native-Gradient-PAGE蛋白电泳法，具有如下优点：所需试剂都是常规试剂，且使用常规SDS-PAGE电泳仪器就可以进行操作；电泳分离效果明显，灵敏度高，电泳结束后，不同蛋白分子因泳动速率不同，颗粒尺寸大小不一，则处于不同的泳道位置；通过此蛋白电泳，易于将天然蛋白各组分分离。

主权项

一种用于天然蛋白分子分离鉴定的梯度电泳方法，其特征是按以下步骤：（1）配置梯度胶、堆积胶及缓冲液：a）8~15%梯度胶溶液：40%的储液，其中丙烯酰胺中丙烯酰胺:N，N‑甲叉双丙烯酰胺= 29:1，1.5M的 pH=8.8的三羟甲基氨基甲烷‑盐酸以及10%的过硫酸铵、超纯水、四甲基乙二胺；b）堆积胶溶液：40%的储液，其中丙烯酰胺中丙烯酰胺:N，N‑甲叉双丙烯酰胺=29:1，0.5M的pH=6.8的三羟甲基氨基甲烷‑盐酸以及10%的过硫酸铵、超纯水、四甲基乙二胺；c) 上样缓冲液：0.5M的pH=6.8的三羟甲基氨基甲烷‑盐酸、0.5%的3,3’,5,5’‑四溴苯酚磺酰酞、丙三醇、超纯水；d）电极缓冲液：0.025M三羟甲基氨基甲烷、0.192M的甘氨酸；（2)上样：采用凝胶电泳系统，凝胶板长度为74mm；样品与等体积2×的上样缓冲液混合均匀，离心1min；取10μl加入上样孔中；（3）电泳：电泳条件堆积胶为电压60 V，时间30分钟；梯度胶为电压80V，时间120分钟；电泳时采用常规方法冷却，电泳温度控制在15℃以下；（4）混合物中不同组分蛋白质分离的判定：电泳后凝胶经染色，脱色后成像，分析蛋白分离情况；经参考纯蛋白的对照，根据每个泳道里的分离的条带，分别判定混合物中不同组分的蛋白，并通过Quality One软件定量出不同组分蛋白的纯度。