| 摘要 |
1. Препарат рекомбинантного орексина А человека, представляющего собой последовательность из 33 аминокислот с молекулярной массой 3583 Да (SEQ ID NO:1), для лечения заболеваний, связанных с дисфункцией орексин-содержащих систем, поддержания состояния бодрствования, коррекции пищевого поведения.2. Плазмидная ДНК pG-hOrexA, размером 5859 п.о., содержащая вставку гена orexA, кодирующего человеческий орексин А по п.1, а также следующие компоненты: а) промотор для полимеразы фага Т7, что обеспечивает контроль уровня экспрессии гена, б) lac-оператор для обеспечения контролируемой экспрессии гена, кодирующего необходимый белок, в) сайт связывания с рибосомальным комплексом (RBS), г) старт кодон для трансляции клонированного фрагмента, д) фрагмент rор обеспечивает оптимальную копийность плазмиды, е) pBR322ori для осуществления инициации репликации, ж) lacI - лактозный репрессор для обеспечения работы lac-оперона, з) сайт устойчивости к ампициллину для селекции клонов, содержащих плазмиду.3. Способ получения высокоочищенного препарата нативного рекомбинантного орексина А человека, заключающийся в том, что 1) клонируют кДНК гена, кодирующего орексин А человека, в составе плазмидной ДНК 2) трансформируют клетки E.coli штамма DH10B (FmcrA, Δ(wrr-hsdRMS-mcrBC), φ80dlacZΔM 15, ΔlacX74, deoR, recA1, endA1, araD139, Δ(ara,leu)769, galU, gaIKλ, rpsL, nupG) методом электропорации 3) выделяют рекомбинантную плазмидную ДНК (pG-hOrexA), 4) трансформируют клетки E.coli штамма BL21 для получения рекомбинантного белка в больших количествах созданной плазмидой методом электропорации, 5) проводят индукцию экспрессии гена, кодирующего данный белок, в клетках E.coli штамма BL21 (с генотипом F-ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne131) 0.2% лактозой по методу Штудие� |
