猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的制备方法及用途

摘要

本发明公开了猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的制备方法，其包括：选取猪疫苗抗体阳性的猪屠宰，收获猪脾脏；低温保藏；解冻猪脾脏；去筋膜；绞碎；匀浆；装瓶、储存；反复冻融；离心；微滤；超滤；灭活；pH调节；渗透压调节；除菌；质量检测。本发明在匀浆步骤中将注射用水的pH值调节至4-6，有利于提高核糖、多肽得率。本发明采用盒式膜包切向流过滤，系统残留死体积小，易于线性放大生产。本发明将转移因子粗制品经1-3KD盒式膜包进行切向流纳滤，制得高浓度转移因子，提高使用效果。本发明使用酚红作酸碱指示剂，方便客户观察转移因子的pH值。本发明的转移因子，使用β-丙内酯替代传统甲醛灭活，加入渗透压调节工艺，有利于转移因子与疫苗的联合免疫。

主权项

猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：1) 对健康猪免疫一种以上的猪疫苗，每种猪疫苗免疫2次以上，相邻两次免疫时间间隔为7天以上，最后一次免疫猪疫苗后14‑28天，检测猪疫苗抗体，选取猪疫苗抗体阳性的猪屠宰，收获猪脾脏；2) 低温保藏：收获的猪脾脏立即保存于‑40℃以下，保存时间不超过20天；3) 解冻猪脾脏：将低温保藏的猪脾脏经流水解冻，解冻温度低于37℃，解冻后用纯化水洗3‑5遍，弃去硬化、坏死的猪脾脏；4) 去筋膜：解冻后去除猪脾脏表面的筋膜、脂肪组织，经注射用水洗3‑5遍；5) 绞碎：将经注射用水清洗过的猪脾脏放入绞肉机初绞1‑2遍；6) 匀浆：用HCl溶液将注射用水的pH值调节至4‑6，与绞碎后的猪脾脏按重量比1‑2:1混合，经胶体磨匀浆，得匀浆液；7) 装瓶、储存：将匀浆液分装于无热源的瓶子后，立即保存于‑40℃以下，保存时间不超过20天；8) 反复冻融：将瓶装匀浆液经流水解冻，解冻温度低于37℃，解冻后立即于‑40℃以下冷冻，反复冻融3‑6次；9) 离心：将反复冻融后的匀浆液于4℃、5500‑8000 r/min离心15‑30 min，收集上清液；10) 微滤：将步骤9)得到的上清液采用0.1‑0.45 μm盒式膜包进行切向流微滤：当微滤透过物体积达到上清液体积的2/3‑3/4时，对微滤截留物进行恒体积透析，至微滤透过物体积增加了微滤截留物体积的0.1‑1倍为止，收集微滤透过物即为澄清液；11) 超滤：将步骤10)得到的澄清液采用5‑10 KD盒式膜包进行切向流超滤：当超滤透过物体积达到澄清液体积的4/5‑6/7时，对超滤截留物进行恒体积透析，至超滤透过物体积增加了超滤截留物体积的1‑2.5倍为止，收集超滤透过物即为猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品；12) 灭活：将β‑丙内酯与猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品，按体积比1：4000‑100000混匀，在4℃下80‑200 r/min的转速下灭活6‑24 h，灭活后置于37℃下水解2‑8 h；13) pH调节：将灭活后的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品的pH值调节至6.8‑7.2；14) 渗透压调节：将pH调节后的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品的渗透压调节至280‑320 mosm/kg； 15) 除菌：将渗透压调节后的猪疫苗特异性猪脾脏转移因子粗制品采用0.1 μm的除菌过滤器除菌，即得猪疫苗特异性猪脾脏转移因子；16) 质量检测：猪疫苗特异性猪脾脏转移因子的性状为微黄色或黄色透明液体，多肽含量不低于2.5 mg/mL，核糖含量不低于50 μg/mL，内毒素含量不超过10 EU/mL，按照《中国兽药典》的要求进行检测后应无菌，pH值为6.8‑7.2，渗透压值为280‑320 mosm/kg，磺基水杨酸蛋白质定性测定为阴性，鉴别检验中在250‑260 nm的波长处有最大吸收、OD260nm/OD280nm的比值应不低于1.9，脱E受体法效力检验不低于10.0%，安全检验合格，即为质量检测合格。