一种快速检测贝类毒素的方法

摘要

本发明公开了一种快速检测贝类毒素的方法，所述方法包括以下步骤：1)样品毒素的提取净化；2)毒素的鉴定；3)毒素-BSA偶联抗原制备；4)毒素单克隆抗体制备及纯化；5)免疫磁性微球的制备；6)制备葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物；7)混合标记物的纯化；8)荧光免疫层析试纸条制备。所述方法特异性强、检测限低、并能实现抗原成分的定量检测。

主权项

一种快速检测贝类毒素的方法，包括以下具体步骤：1)、样品毒素的提取净化；2)、毒素的鉴定；3)、毒素‑BSA偶联抗原制备采用碳二亚胺法进行毒素与载体蛋白偶联，毒素‑BSA完全抗原用于制备毒素单克隆抗体；4)、毒素单克隆抗体制备及纯化；5)、免疫磁性微球的制备：5.1、水产品生物毒素单克隆抗体偶联生物素将活化好的生物素溶解于DMSO中，使其浓度为2.5mg/mL，分装后，置于‑20℃保存；每2mL浓度为5mg/mL的毒素单克隆抗体，在0.1M pH8.5的碳酸盐缓冲液中，透析过夜，第二天取出，备用；取透析好的毒素单克隆抗体1.6mL，约8mg，加1M pH8.5碳酸盐缓冲液300uL，混匀后，再加生物素500uL，室温搅拌2h；加入饱和硫酸铵，使硫酸铵饱和度为50％，4℃搅拌0.5小时；离心，弃上清，取沉淀，用1×PBS溶解后，再加入饱和硫酸铵，使硫酸铵饱和度为50％，4℃搅拌0.5小时；弃上清，取沉淀，用3.0mL1×PBS溶解，在1×PBS中透析24h，终体积为4mL，PAGE及ELISA检测产物效价；5.2、磁性微球的制备把0.01g Fe/C纳米磁粉分散于2ml壳聚糖水溶液中，并逐滴滴入溶解有表面活性剂AOT的甲苯溶液中，机械搅拌乳化；滴入25％戊二醛溶液，在2000r/min机械搅拌下反应1小时；反应后用乙醇、丙酮、蒸馏水反复洗涤洗去表面活性剂和有机溶剂，用磁分离架分离出磁性成分；使之分散在蒸馏水中4℃保存，取出其中1ml真空干燥48小时计算其中固体含量，调节微球浓度使最终浓度为1mg/ml，1ml的悬浮液含有微球约1×1010，由于戊二醛用作交联剂，磁性载体表面含有丰富的悬垂的醛基；5.3、磁性微球与链霉亲和素的连接在磁场作用下用pH6.0浓度为10mmol/L的NaH2PO4缓冲液洗涤1ml磁珠，在圆底小烧瓶中加入连接液，混匀，室温下摇床中震荡15min，避免磁珠沉淀，并起混匀作用，磁场下用缓冲液B：HCl2mmol/L洗涤，用缓冲液C：NaH2PO4或Na2HPO4，20mmol/L，pH7.5重悬磁珠，立即加入100uL链霉亲和素，重悬在PBS液中；连接有链霉亲和素的磁珠即可与偶联生物素的毒素单克隆抗体相结合；6)、制备葡聚糖‑抗体‑荧光素混合标记物；7)、混合标记物的纯化7.1葡萄球菌G蛋白亲和层析；7.2用Sephadex‑G25凝胶柱纯化荧光素标记的单克隆抗体：将亲和层析后的葡聚糖‑抗体‑荧光素混合标记物过Sephadex‑G25凝胶柱进行层析，葡聚糖‑抗体‑荧光素混合标记物会因为其大分子量而首先从纯化柱中洗脱出来，而相对分子量较小的单克隆抗体则在上述峰值之后才缓慢从纯化柱中洗脱出来；葡聚糖‑抗体‑荧光素混合标记物经透析后存放于缓冲液中，缓冲液配方为：0.5％(重量)BSA+3％(重量)海藻糖+0.1％(重量)Tween‑20，10m M pH7.5Tris‑HCL；8)、荧光免疫层析试纸条制备作用原理：采用双抗体夹心法原理定量检测样品中生物毒素；结果判断：用制备的试纸条检测样品中的生物毒素，每一种毒素检测试纸条上均有对照线C和检测线T，不同毒素检测判断的原则相同。