微载体培养Marc-145细胞增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒的多次收毒工艺

摘要

本发明公开了微载体培养Marc-145细胞增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒的多次收毒工艺，是以2g/L-10g/LCytodex-1或GF-240两种微载体培养Marc-145细胞，以M.O.I为0.01—0.1接种PRRS病毒液，各分成两组，一组为对照组，另一组为试验组，对照组接种病毒后的24h、48h和72h取样测定TCID50，试验组接种病毒后每隔24-28h分别收获上清病毒液后补加维持液继续培养，可收获2-3次。本发明的有益效果为：本发明提供一种微载体培养Marc-145细胞增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒的多次收毒工艺技术，在微载体培养条件下Marc-145细胞增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒时多次收毒方式所获符合标准的病毒液是正常收毒方式的两倍以上，提高了微载体和种子细胞的利用率，降低疫苗的生产成本。

主权项

微载体培养Marc‑145细胞增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒的多次收毒工艺，其特征在于，包括以下步骤： 1）微载体处理：将Cytodex‑1型微载体经pH为7.2±0.1的无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液浸泡3h，1g微载体需用20‑100ml的缓冲液浸泡之间，并洗涤2次，用PBS将微载体配成2‑10g/L的浓度后转移到生物反应器中，以121℃高压蒸汽灭菌30min，自然冷却后静置，用含体积百分含量10%NBS的DMEM培养液清洗2遍后备用，所述PBS缓冲液的渗透压在290～320mmol/kg，或将GF‑240型微载体先用含体积百分含量万分之一吐温的纯净水浸泡溶胀3h，1g微载体需用20—100ml的含吐温的纯净水浸泡，用pH为7.2±0.1的无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液洗2次，用PBS将微载体配成2‑10g/L的浓度后转移到生物反应器中，以121℃高压蒸汽灭菌30min，自然冷却后静置，用含体积百分含量10%NBS的DMEM培养液清洗2遍后备用，所述PBS缓冲液的渗透压在290～320mmol/kg之间；2）微载体培养Marc‑145细胞：利用方瓶或转瓶扩大培养Marc‑145细胞，经质量百分比浓度为0.25%胰蛋白酶消化，按每个微载体15—20个细胞的量接种到步骤1）所述的微载体悬液中，补加含体积百分含量10%NBS的DMEM培养液至培养终体积的一半后培养，生物反应器的参数设置为：温度37℃、pH7.2、溶氧30‑60%，转速以微载体能完全搅成悬浮状的最低转速，在25—50rpm之间，在培养前3h内采用间歇搅拌的方式，所述间歇搅拌是搅拌3‑5min,停止25—30min,再搅拌3‑5min的反复搅停过程，培养3h后采用固定转速持续搅拌，培养24h时补加含体积百分含量10%NBS的DMEM培养液至最终体积；3）细胞培养过程监控和处理：从培养的24h起每12—24h取样观察细胞生长情况、计数细胞密度和检测培养液中葡萄糖的剩余量，并根据培养液葡萄糖的含量换加含体积百分含量10%NBS的DMEM培养液，以保证生物反应器中细胞液的葡萄糖含量≥1g/L，至到每克微载体上细胞总数达到2.5×108个以上，若培养体积为3.5L的生物反应器中微载体投放量为15g，则细胞总量要达到3.75×109个以上；4）接种病毒：将步骤3）得到的微载体培养的停止搅拌5‑10 min待微载体沉到反应器底时弃去上清，按M.O.I0.01—0.1接种PRRS病毒液，补加细胞培养最终体积一半的维持液培养，生物反应器参数设置：温度37℃、pH7.3±0.1、溶氧30‑60%，转速以微载体能完全搅成悬浮状的最低转速，在25—50rpm之间，按步骤2）的方法在培养前2h内采用间歇搅拌的方式，培养2h后采用固定转速持续搅拌，所述维持液为含体积百分含量3%NBS的DMEM培养液；5）收获病毒：在接毒培养后每隔24h—28h，停止搅拌5‑10 min，待微载体沉到反应器底时收获上清液，收获后加维持液到培养终体积继续培养再收获上清液，可收获2‑3次。