低免疫原性猪真皮支架的制备方法

摘要

本发明公开了一种低免疫原性猪真皮支架的制备方法，包括如下步骤：①制备“双断层”真皮、②脱细胞处理、③基质金属蛋白酶-7处理和④真空冷冻干燥处理。它是以猪皮肤为原料，以保留猪真皮胶原纤维等低免疫原性成分及其为基础的天然三维结构、去（脱）除细胞和层粘连蛋白、纤维连接蛋白等基质蛋白等高免疫原性成分为目标要求，通过改进皮肤取材及处理、优选脱细胞方法、建立脱基质蛋白技术、优选交联剂、真空冷冻干燥技术等手段，制备低免疫原性猪真皮支架材料。它可达到降低猪真皮免疫原性至人体能够耐受的水平，同时保留其天然三维结构，以原位构建组织工程化组织方式引导人真皮“有序”再生重建的目的，可解决现有技术存在的问题。

主权项

低免疫原性猪真皮支架的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：①制备“双断层”真皮：a.将家猪处死去毛，剥离其皮肤和部分皮下组织，消毒冲洗；b.先削除皮肤的表皮及真皮乳头层，再削除皮下组织及与其相连的真皮部分网状层,保留0.5‑0.6mm厚真皮网状层，即为“双断层”真皮；②脱细胞处理：a.配制2.5U/ml中性蛋白酶（Dispase II）溶液及体积分数0.5%聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX‑100）溶液；b.先将步骤①中所述“双断层”真皮置于2.5U/ml Dispase II溶液中，于4℃条件下作用24h，每平方厘米的0.5‑0.6mm“双断层”真皮至少需要2.5ml的2.5U/ml Dispase II溶液；再将“双断层”真皮取出，PBS洗涤3次，每次5min；然后，将“双断层”真皮置入体积分数0.5% TritonX‑100溶液中，于4℃条件下作用24h，每平方厘米的“双断层”真皮至少需要5ml的体积分数0.5% TritonX‑100溶液；取出“双断层”真皮，PBS洗涤5次，每次5min；该工序能脱除“双断层”真皮中的细胞成分，将其制成 “双断层”异种脱细胞真皮基质，即“双断层”Xeno‑ADM；③基质金属蛋白酶‑7 (MMP‑7)处理：先将步骤②所述“双断层”Xeno‑ADM置于0.5 U/ml MMP‑7溶液中，于4℃条件下作用12‑16h，再于37℃条件下作用8h，每平方厘米的0.5‑0.6mm“双断层” Xeno‑ADM需要至少2.5ml的MMP‑7溶液浸泡；再将“双断层”Xeno‑ADM取出，PBS洗涤3次，每次5min；然后，将“双断层”Xeno‑ADM置入体积分数0.5% TritonX‑100溶液内，于25℃下，振荡洗涤24h，每平方厘米的0.5‑0.6mm“双断层”Xeno‑ADM至少需要5ml体积分数0.5% TritonX‑100溶液进行振荡洗涤；PBS充分洗涤5次，每次10min；该步骤处理能脱除“双断层”Xeno‑ADM中层粘连蛋白（LN）、Ⅳ型胶原蛋白（Col Ⅳ）及其他高抗原性成分，将“双断层” Xeno‑ADM制成网状层真皮支架；④真空冷冻干燥处理：将上一步骤的网状层真皮支架在－40℃条件下冷冻1h，之后抽真空17h，以进一步降低网状层真皮支架免疫原性，扩大其相对空间结构，提高渗透性，从而制成低免疫原性猪真皮支架；经步骤③处理后得到的网状层真皮支架，在进行步骤④真空冷冻干燥处理前，先应用京尼平（Genipin）处理，以增强网状层真皮支架的韧性、降低其降解速率；京尼平（Genipin）处理操作如下：网状层真皮支架应用0.5%（w/v）的京尼平（Genipin）溶液，在25℃下交联6h；之后，再置入25%（w/v）饱和甘氨酸溶液中中和多余的京尼平（Genipin），每平方厘米的0.5‑0.6mm网状层真皮支架至少需要在2.5ml的25%（w/v）饱和甘氨酸溶液中进行中和处理；步骤①中a工序所述消毒冲洗具体操作如下：将所述的皮肤和部分皮下组织置入0.1%（w/v）新洁尔灭溶液中浸泡消毒10‑15min，取出后用等渗盐水冲洗3次，再置抗生素盐水溶液中浸泡10min；抗生素盐水溶液是由每500ml等渗盐水中加庆大霉素32万U而制得的溶液；步骤①中的“双断层”真皮的切取尺寸为100mm×100mm。