单管同时检测四种牛传染病RNA病毒的PCR方法

摘要

本发明公开了一种在单个PCR反应管中同时检测四种靶核酸的实时荧光PCR方法，用于检测样品中牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹泻病毒、牛呼肠孤病毒。本方法操作快速、一步完成。另外，本发明还涉及上述PCR方法中所涉及的试剂，用于上述方法的检测试剂盒和该检测试剂盒的制备应用等。

主权项

在单个PCR反应管中同时检测四种靶核酸的实时荧光PCR方法，所述靶核酸来自牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹泻病毒、牛呼肠孤病毒，同时用RNA内标进行全程监控，步骤主要包括： (1)提取样品中的核酸，获得病毒总核酸提取液； (2)在所述单个PCR反应管中混合核酸提取液、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物对和探针、内标引物对及探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，其中， 靶核酸引物对包括： 牛副流感病毒： BPIV‑L：GGA TGT TAT TTG ACG CCAACAA BPIV‑R：TCC CTC TAT CGA GTG GAA GAC ACT 口蹄疫病毒： FMDV‑L：GAACACATTCTTTACACCAGGAT FMDV‑R：CATATCTTTGCCAATCAACATCAG 牛腹泻病毒： BVDV‑L：TGGTTCGACGCCTTGGTATA BVDV‑R：CCCCGCTCAGGTTAAGATGT 牛呼肠孤病毒： REO‑L：GATCCTGATGTCTTGCGTCTAA REO‑R：CAGCAGTATTCCCGTCGATAAT 内标： IC‑F‑L：CTCGAGAACGCAAGTTC IC‑F‑R：GGTGATTTCACCTCCAGTAT 靶核酸探针包括： 牛副流感病毒： BPIV‑P：TTG CGC TTG CAC C 口蹄疫病毒： FMDV‑P：ACAACCTACCGCCGAGCCAATTC 牛腹泻病毒： BVDV‑P：TGGTTCGACGCCTTGGTATA 牛呼肠孤病毒： REO‑P：AATTACGTGTGTCAAGGTGACGATGGA 内标： IC‑F‑P：CACGACAGTGGTCGCTACATA (3)进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光信号； (4)根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有靶核酸存在于样品中。