一种芦笋近缘野生种羊齿天门冬的原生质体的制备方法

摘要

一种进行高效制备芦笋近缘野生种羊齿天门冬嫩茎原生质体的制备方法，其具体步骤是：(1)选取长10-15cm的羊齿天门冬嫩笋，剥掉鳞片，剪去顶端鳞片包被的部分，切成2-3cm小段，并用刀片削去表皮；(2)在自来水下轻轻擦洗10min，于无菌操作台中，通过75％酒精消毒5min，用无菌蒸馏水冲洗2次，再用10％的次氯酸钠消毒10min，用无菌蒸馏水冲洗4次，并切成0.1-0.2cm薄片，无菌条件下称量1.0g置于50mL无菌试管中；(3)在试管中加入适量酶解液，于25℃-28℃遮光的摇床上100rpm进行振荡酶解；(4)酶解结束后，过滤酶液，除去未被酶解的剩余组织样品，获得含有该原生质体的过滤液，并通过离心、洗涤等步骤获得纯化的原生质体。

主权项

一种芦笋近缘野生种羊齿天门冬的原生质体的制备方法，其特征在于包括下列操作步骤：(1)选取长10‑15cm的羊齿天门冬嫩笋，剥掉鳞片，剪去顶端鳞片包被的部分，切成2‑3cm小段，并用刀片削去表皮；(2)在自来水下轻轻擦洗10min；(3)于无菌操作台中，通过75％酒精消毒5min，用无菌蒸馏水冲洗2次；(4)用10％的次氯酸钠消毒10min，用无菌蒸馏水冲洗4次；(5)用无菌棉布吸干嫩笋表面蒸馏水，将上述嫩笋小段切成0.1‑0.2cm薄片，无菌条件下称量1.0g置于50mL无菌试管中；(6)在试管中加入10mL纤维素酶、果胶酶和蜗牛酶的混合酶液，于25℃‑28℃遮光的摇床上100rpm进行振荡酶解，渗透压稳定剂组成成分为：0.1％MES+0.2％的CaCl2·2H2O+0.8mol／L葡萄糖，配置好后用直径为0.45μm的超微微孔滤膜过滤除菌；所述混合酶液由下列重量配比的物质组成：纤维素酶5g／L、果胶酶3g／L、蜗牛酶5g／L、渗透压稳定剂；(7)酶解结束后，用200目不锈钢滤网过滤酶液，除去未被酶解的剩余组织样品，获得含有该原生质体的过滤液，滤液于温度4℃、转速3000‑4000r／min、离心分离5‑10min，使原生质体沉淀；弃上清液，用浓度0.8mol／L的蔗糖溶液洗涤1‑2次，保留沉降的原生质体；原生质体纯化采用KMG溶液和蔗糖密度离心法，在离心管中加入0.8mol／L的蔗糖8ml，并于管壁小心加入KMG溶液2ml，温度4℃下3000‑4000r／min离心5‑10min，收集悬浮于两液相之间的蔗糖溶液顶部形成的原生质体带；稀释至一定体积后进行计数，测定原生质体产量。