一种巨尾桉转化方法

摘要

本发明提供了一种安全高效的巨尾桉遗传转化方法，以便解决现有技术中所述农杆菌介导法转化桉树所遇到的问题。本发明通过构建以安全性标记基因PMI(6-磷酸甘露糖异构酶)为筛选标记的表达载体，通过大量的组培试验及对遗传转化方法的改进，最终将目的基因AmCBL1成功转入巨尾桉中。该目的基因来源于超旱生植物沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus(Maxim.)Cheng f.)，由其特异性启动子AmCBL1P所驱动。

主权项

一种巨尾桉转化方法，包括以下步骤：（1）将目的基因AmCBL1连入含有6‑磷酸甘露糖异构酶PMI的表达载体pCAMBIA1301上，将所述载体导入根癌农杆菌EHA105；（2）将所述农杆菌于含有100mg/mL卡那霉素和50mg/mL利福平的YEB培养基中，28℃，180转/分钟，避光摇至OD值为0.4～0.6；8000转/分钟，离心10分钟，沉淀收集菌体；（3）使用含有乙酰丁香酮50mg/L、2‑(N‑吗啡啉)乙磺酸150mg/L和半乳糖1.8g/L的无蔗糖MS液体培养基悬浮菌体，悬浮后的菌液OD值仍调至0.4～0.7；（4）取巨尾桉组培苗茎段，剪为0.5厘米左右，接种于预培养愈伤诱导培养基中，在温度为25±2℃的培养室中，暗培养1天，进行预培养，所述预培养愈伤诱导培养基是含苯基噻二唑脲0.5mg/L、萘乙酸0.1mg/L、蔗糖30g/L和琼脂7g/L的MS培养基；（5）取悬浮后的菌液侵染经预培养的巨尾桉茎段，侵染时间为4～7分钟；侵染后接种至共培养愈伤诱导培养基中，在温度为25±2℃的培养室中，暗培养3天中，进行共培养，所述共培养愈伤诱导培养基是含羧苄青霉素200mg/L、苯基噻二唑脲0.5mg/L、萘乙酸0.1mg/L、蔗糖30g/L和琼脂7g/L的MS培养基；（6）将共培养后的茎段转接至筛选阶段的愈伤诱导培养基中，在温度为25±2℃的培养室中，暗培养40～45天，进行选择性培养，所述筛选阶段的愈伤诱导培养基是含有羧苄青霉素200mg/L、苯基噻二唑脲0.5mg/L、萘乙酸0.1mg/L、蔗糖19g/L、甘露糖11g/L和琼脂7g/L的MS培养基；（7）统计选择性培养后的愈伤组织诱导率，将产生的愈伤组织接至筛选阶段的分化培养基中，在光照强度为1500～2000勒克斯、光周期为18小时/天、温度为25±2℃的培养室内进行芽分化培养，所述筛选阶段的分化培养基中是含有羧苄青霉素200mg/L、蔗糖19g/L、甘露糖11g/L和琼脂7g/L的MS培养基；（8）约25～30天后，将分化得到的芽编号，并移入新的筛选阶段的分化培养基中继续进行分化培养；（9）取分化培养中高约2厘米左右的小芽，接入筛选阶段的生根培养基中，在光照强度为1500～2000勒克斯、光周期为18小时/天、温度为25±2℃的培养室内进行生根培养，40～45天后将生根巨尾桉幼苗移入土中，所述筛选阶段的生根培养基是 含有羧苄青霉素200mg/L、IBA0.5mg/L、萘乙酸0.5mg/L、蔗糖19g/L、甘露糖11g/L和琼脂7g/L的1/2MS培养基；（10）取经筛选培养得到的巨尾桉株系叶片进行氯酚红检测，转化成功的株系的检测液产生变色反应；用转化成功的株系提取DNA，以AmCBL1基因正向引物AmCBL1‑1和反向引物AmCBL1‑2为引物，经PCR反应进行转基因鉴定，确定这些株系的DNA中是否获得了目的基因。