禽流感病毒原位PCR检测探针及其制备方法

摘要

本发明公开了一种特异性好、敏感性高的禽流感病毒原位PCR检测探针及其制备方法。该方法从GeneBank下载禽流感病毒NP基因序列，通过比对选取NP基因中较为保守的片断，设计一对引物，通过RT-PCR方法扩增270bp的目的片段，并分子克隆构建重组质粒测序，测序后证实本研究设计的引物扩增序列与AIV各亚型NP基因具有较高同源性，可达92％以上，利用地高辛标记扩增产物制备探针。该探针用于间接原位RT-PCR检测方法对细胞内的禽流感病毒进行检测和定位，可特异性的检测禽流感病毒，而新城疫、传染性法氏囊等病毒检测为阴性，具有良好的特异性，探针可以检测到约1pg/uL的质粒DNA，具有高敏感性。

主权项

一种禽流感病毒原位PCR检测探针，其特征在于，根据GenBank数据库中AIV NP基因的核苷酸序列设计引物，运用RT‑PCR法制备所述检测探针的特异性引物序列为SEQ1，SEQ2：SEQ1：5’‑AAGCGGAGGAAACACCAAC‑3’；SEQ2：5’‑ATGTCAAAGGAAGGCACGAT‑3’；该探针的制备过程如下：(1)特异性引物的设计，根据GenBank数据库中AIV NP基因的核苷酸序列设计上游引物SEQ1和下游引物SEQ2；(2)病毒RNA的提取；(3)利用上述引物SEQ1和SE92，以提取的病毒RNA为模板进行一步法RT‑PCR扩增反应，获得RT‑PCR产物并用琼脂糖凝胶电泳分析；(4)RT‑PCR产物的克隆，把RT‑PCR产物与克隆载体连接，连接产物转化感受态细胞，提取重组质粒；(5)对上述重组质粒进行PCR鉴定和测序，筛选阳性质粒；(6)将上述测序确定正确的DNA作为模板，加入DIG‑High Prime制备探针。