一种重组人源胶原蛋白及其制备方法

摘要

本发明公开了一种重组人源胶原蛋白，氨基酸序列如SEQNO.3，其含有599个氨基酸，分子量为55.0kDa。其制备方法为：表达重组人源胶原蛋白基因工程菌的构建，得到巴氏毕赤酵母基因工程菌；对基因工程菌进行发酵培养，实现重组人源胶原蛋白的诱导表达，得到含有重组人源胶原蛋白的发酵液；从发酵液中纯化重组人源胶原蛋白。本发明设计的人源胶原蛋白基因Ge1是全新的序列，且长度上大大少于天然人胶原蛋白基因(数Kbp)，实现了在分子水平的操作简单化，更易实现胶原蛋白的基因工程菌发酵生产；该人源胶原蛋白基因Ge1同时包含天然人胶原蛋白基因的特征，其表达的蛋白将具有天然人胶原蛋白的优良特征。

主权项

氨基酸序列如SEQ NO.3所示的重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于，一、表达重组人源胶原蛋白基因工程菌的构建如下：1) 基于人Ⅲ型胶原蛋白α1链胶原域Gly‑X‑Y的三肽重复序列特征，设计并人工合成一段人源胶原蛋白基因单体，其核苷酸序列如SEQ NO.1；然后通过体外酶切连接，利用大肠杆菌作为克隆宿主，构建含有同向六串联人源胶原蛋白基因单体的表达载体，该同向六串联人源胶原蛋白基因单体的核苷酸序列如SEQ NO.2；2) 将重组表达载体转入巴氏毕赤酵母进行重组人源胶原蛋白的表达，得到的巴氏毕赤酵母基因工程菌，其已在保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC NO. 5021；二、基因工程菌的发酵培养条件及重组人源胶原蛋白诱导表达条件为：1）将种子培养基培养的工程菌按10%接种量加入含分批发酵培养基发酵罐中开 始培养，调节搅拌转速为500 r/min ‑800 r/min 、罐压为0.2‑1.0bar、空气流量为200 In/h ‑300 In/h，使溶氧>30%，其中种子培养基配方为：100mM pH6.0的磷酸缓冲液，1.34％YNB，4×10‑5％生物素，1％V/V甘油，而且，其中分批发酵培养基配方为：85% H3PO4  26.7ml/L；CaSO 4  0.93g/L；K2SO4  18.2g/L；MgSO4·7H2O  14.9g/L；KOH  4.13g/L；甘油  40.0g/L，灭菌后再加入PTM1微量元素；其中PTM1微量元素为：CuSO4·5H2O  6.0g/L；NaI  0.08g/L；MnSO4·H2O  3.0g/L；NaMoO4·2H2O  0.2g/L；H3BO3  0.02g/L；CoCl2  0.5g/L；ZnCl2  20.0g/L；FeSO4·7H2O  65.0g/L；生物素  0.2g/L；H2SO4  5.0ml/L，用0.22μm的滤膜过滤除菌，室温保存；2）当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加补料生长培养基，流加速率为维持溶氧>20%，至菌体湿重达180~220g/L，停止补加甘油，其中补料生长培养基配方为：50%W/V甘油，每升含12mL的PTM1微量元素；3）甘油耗尽后补入发酵诱导培养基进行诱导表达，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧>20%，诱导发酵96‑120h后，结束发酵，收集发酵液，其中发酵诱导培养基配方为：100%甲醇，每升含12mL的PTM1微量元素；三、重组人源胶原蛋白的提取纯化如下对发酵液进行离心分离，收集上清液，上清液经滤膜过滤后，用Sephadex G100凝胶柱层析分离纯化，再经冷冻干燥得到成品。