一种基于核酸适配体的卡那霉素残留的检测方法

摘要

一种基于核酸适配体的卡那霉素残留的检测方法，属于分析化学技术领域。本发明利用巯基共价修饰的方式，将与卡那霉素适配体两端互补的单链DNA（ssDNA）分别修饰在金纳米颗粒（AuNPs）表面，得到两种功能化的AuNPs。加入卡那霉素适配体使之与功能化AuNPs表面的ssDNA配对结合，拉近AuNPs之间的空间距离，介导AuNPs聚集。在与存在不同浓度卡那霉素样品混合后，卡那霉素与适配体的特异性结合使得聚集体解聚，表现为紫外-可见光谱中AuNPs特征吸收峰的变化。利用527nm处吸光度的变化和卡那霉素浓度之间的关系实现对卡那霉素残留的检测。该方法具有良好的重复性、稳定性，易操作和高灵敏度，可用于对经过预处理的牛奶等样品中的卡那霉素残留进行直接测定。

主权项

一种基于核酸适配体的卡那霉素残留的检测方法，其特征在于将两段分别与卡那霉素适配体aptamer两端互补配对的ssDNA分别修饰在金纳米颗粒AuNPs表面，得到两种功能化的AuNPs；然后加入卡那霉素适配体使之与功能化AuNPs表面的ssDNA互补配对结合，介导两种功能化AuNPs之间发生聚集；当加入含有卡那霉素样品的溶液时，卡那霉素与其适配体特异性竞争结合，使AuNPs聚集体重新分开；根据随之产生的紫外‑可见光谱的变化对样品中卡那霉素浓度进行分析；方法包括以下步骤：功能化AuNPs的制备，卡那霉素适配体与功能化AuNPs表面的ssDNA互补配对结合，样品的加入和紫外‑可见光谱表征，卡那霉素残留的检测；（1）两种功能化AuNPs的制备步骤如下：采用经典的柠檬酸钠还原法制备直径13 nm的AuNPs；将100μL、500 nM的分别在3’端及5’端带有巯基的、与卡那霉素适配体两端互补的ssDNA分别加入到150μL、17.5nM的AuNPs中，室温下静置16 h，使带有巯基的ssDNA共价连接到AuNPs表面；然后加入20μL含0.1 M NaCl的 pH8.3、10 mM的PBS缓冲液静置24 h；再加入10 μL的0.1% BSA静置1 h，封闭AuNPs表面的结合位点；然后以12000 r/min离心20 min除去未修饰上的ssDNA，得到的两种ssDNA修饰好的AuNPs重悬于300μL、pH7.0、1mM PBS缓冲液中，即得到功能化AuNPs，4℃保存；上述3’端及5’端带有巯基的ssDNA序列为：ssDNA 1: 5’‑HS‑(CH2)6‑CGGTCGGCTTA‑3’，ssDNA 2: 5’‑AACCCCCATCT‑(CH2)3‑SH‑3’；（2）卡那霉素适配体与功能化AuNPs表面的ssDNA互补配对结合步骤如下：在两种经ssDNA修饰的功能化AuNPs混合溶液中加入100μL浓度为500 nM的卡那霉素适配体，然后加入40μL含0.3 M NaCl的pH8.3、10 mM PBS缓冲液，置于4℃下反应90 min，使两种功能化AuNPs上修饰的ssDNA分别与卡那霉素适配体的两端互补配对，从而AuNPs聚集；卡那霉素适配体的序列为：5’‑TGGGGGTTGA GGCTAAGCCG A‑3’；（3）样品的加入和紫外‑可见光谱表征： 将含有不同浓度的卡那霉素标准溶液加入发生聚集的AuNPs溶液中，混合均匀后室温静置5min后测定紫外‑可见光谱，以527 nm处的吸光值对卡那霉素浓度作图得到标准曲线；（4）卡那霉素残留的检测步骤：将经过溶液状态的或经过预处理的含卡那霉素的样品加入发生聚集的AuNPs溶液中，静置后在相同条件下测定527 nm处的吸光值，从标准曲线计算出卡那霉素浓度。