一种分选人骨髓极小胚胎样干细胞的方法

摘要

本发明涉及一种分选人骨髓极小胚胎样干细胞的方法。该方法的步骤是恒温4℃条件下进行，经肝素盐水抗凝的10mL人骨髓，加入占其3倍体积量的红细胞裂解液30mL，混匀，离心分离10分钟，弃上清液，在沉淀物中加入占其2倍体积量的红细胞裂解液20mL，混匀，离心分离10分钟，再弃上清液，得二次沉淀物，4℃条件下用EDTA缓冲液洗涤，得细胞悬浊液；将细胞悬浊液用30μM网孔滤过，将过滤液在4℃条件下离心分离5分钟，弃上清液，将沉淀物中加入EDTA缓冲液至300μL～310μL得重悬细胞液；再经阴选和阳选步骤。本发明能保持极小胚胎样干细胞的完好性，方法简单实用，简化分选流程，缩短分选时间，提取成本低，能获得较高的回收率的优点。

主权项

一种分选人骨髓极小胚胎样干细胞的方法，其特征在于该方法的步骤是恒温4℃条件下进行，步骤在如下：(1)经肝素盐水抗凝的10mL人骨髓，加入占其3倍体积量的红细胞裂解液30mL，混匀，4℃条件下裂解，离心分离10分钟，弃上清液，在沉淀物中加入占其2倍体积量的红细胞裂解液20mL，混匀，4℃条件下裂解，离心分离10分钟，再弃上清液，得二次沉淀物，4℃条件下用EDTA缓冲液洗涤，得细胞悬浊液；(2)将细胞悬浊液用30μM网孔滤过，将过滤液在4℃条件下离心分离5分钟，弃上清液，将沉淀物中加入EDTA缓冲液至300μL～310μL得重悬细胞液；(3)阴选，取重悬细胞液300μL，加入100μL美天旎130‑092‑211液，充分混匀，4℃放置10分钟，再加入5mL EDTA缓冲液洗涤，在4℃条件下离心分离5分钟，弃上清液，将沉淀物中加入EDTA缓冲液500～550μL，加入美天旎130‑092‑211液200μL及美天旎130‑045‑801液200μL，混匀，4℃放置15分钟；以10mL EDTA缓冲液洗涤，在4℃条件下离心分离5分钟，弃上清液，将沉淀物中加入EDTA缓冲液至500μL，选用美天旎磁珠分选器，LS分选柱，按该美天旎磁珠分选器说明进行分选，收集通过分选柱的细胞，计数为105‑106个，4℃条件下离心收集沉淀物；(4)阳选：取25～27μL的EDTA缓冲液加入步骤(3)最终收集的沉淀物中，得重悬细胞液，再加10μL美天旎130‑059‑901液及10μL美天旎130‑050‑801液，混匀，4℃避光放置30分钟；以1mLEDTA缓冲液洗涤，在4℃条件下离心分离5分钟，弃上清液，将沉淀物中加入EDTA缓冲液至500μL，选用美天旎磁珠分选器，LS分选柱，按该美天旎磁珠分选器说明进行分选，收集吸附在分选柱上的细胞，计数1×104个，离心收集细胞，得人骨髓极小胚胎样干细胞。