| 主权项 |
1.一种在DNA水平鉴定绞股蓝并与乌蔹莓区别的方法，其特征在于：利用药用植物葫芦科绞股蓝DNA特征性片段SCAR标记克隆测序的结果，设计葫芦科绞股蓝SCAR标记的特异引物对，结合葫芦科绞股蓝和葡萄科乌蔹莓植物各自的18SrRNA基因保守区设计引物对做为内参，分别组合成PCR复合体系1和PCR复合体系2进行扩增，对扩增产物进行电泳分析，从而对药用植物葫芦科绞股蓝进行DNA水平鉴定，并与形态上易与绞股蓝混淆的葡萄科乌蔹莓相区别；所述的PCR复合体系1，包含扩增葫芦科绞股蓝SCAR标记359bp片段的引物对WJS-T1和WJS-T2，扩增葫芦科绞股蓝18SrRNA293bp片段的内参引物对WHL-18S-C1和WHL-18S-C2，应用降落PCR程序扩增葫芦科绞股蓝DNA，得到两条葫芦科绞股蓝的359bp和293bp区带，建立的过程如下：(1)采用生物信息分析方法，筛选出19条10merRAPD随机引物，建立RAPD分析体系，找出葫芦科绞股蓝共有的SCAR分子标记J-750；(2)对已获得的葫芦科绞股蓝共有的SCAR分子标记J-750进行克隆测序，获得8份不同来源的葫芦科绞股蓝部分特征DNA序列，长度在766～770bp范围，经采用NCBI的Blast软件分析，获得8份不同来源的葫芦科绞股蓝J-750均为一段新克隆的尚未在NCBI登录的植物DNA序列；(3)利用Oligo6软件针对绞股蓝SCAR分子标记J-750设计特异引物对WJS-T<sub>1</sub>和WJS-T<sub>2</sub>,建立PCR体系扩增葫芦科绞股蓝DNA，扩增得到长度为359bp的特异区带；(4)根据葫芦科绞股蓝18SrRNA基因保守区设计引物对WHL-18S-C<sub>1</sub>和WHL-18S-C<sub>2</sub>，建立PCR体系扩增葫芦科绞股蓝DNA，扩增得到一段长度为293bp的葫芦科绞股蓝18SrRNA基因保守区共有带；(5)将葫芦科绞股蓝SCAR分子标记引物对WJS-T<sub>1</sub>和WJS-T<sub>2</sub>与18SrRNA基因保守区引物对WHL-18S-C<sub>1</sub>和WHL-18S-C<sub>2</sub>组合，建立PCR复合反应体系1，采用降落PCR程序扩增葫芦科绞股蓝DNA模板，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析得到两条区带，其中1条为359bp的葫芦科绞股蓝SCAR特异带，另1条为293bp的葫芦科绞股蓝18SrRNA基因区保守带；所述的PCR复合体系2，包含扩增葫芦科绞股蓝SCAR标记359bp片段的引物对WJS-T<sub>1</sub>和WJS-T<sub>2</sub>，扩增葡萄科乌蔹莓的18SrRNA177bp片段的内参引物对WPT-18S-C<sub>1</sub>和WPT-18S-C<sub>2</sub>，应用降落PCR程序扩增葡萄科乌蔹莓DNA，得到1条葡萄科乌蔹莓的18SrRNA177bp区带，建立的过程如下：(1)根据葡萄科18SrRNA基因保守区设计引物对WPT-18S-C<sub>1</sub>和WPT-18S-C<sub>2</sub>，建立PCR体系扩增葡萄科乌蔹莓DNA，得到一段长度为177bp的葡萄科乌蔹莓18SrRNA基因保守区共有带；(2)将葡萄科乌蔹莓18SrRNA基因保守区引物对WPT-18S-C<sub>1</sub>和WPT-18S-C<sub>2</sub>，与葫芦科绞股蓝SCAR分子标记特异引物对WJS-T<sub>1</sub>和WJS-T<sub>2</sub>组合成PCR复合反应体系2，采用降落PCR程序对葡萄科乌蔹莓DNA模板进行扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，得到1条177bp的葡萄科乌蔹莓18SrRNA基因保守区带，无葫芦科绞股蓝SCAR片段359bp区带；所述的引物对是：<img file="FDA00003089946200021.GIF" wi="1958" he="526" />。 |
