一种富集弧菌噬菌体与生物防制宿主菌的方法

摘要

本发明涉及一种富集弧菌噬菌体与生物防制宿主菌的方法，由于噬菌体的裂解特异性，特定环境和一定状态下的特定宿主菌株的噬菌体不易获得；本方法依据养殖区和海区的弧菌菌株和噬菌体之间在生态和进化上与环境共存的事实，在特定区域设立宿主菌以及噬菌体的长期培养池，可以不断富集、分离该区域特定病原菌宿主的裂解性噬菌体，经过扩增后，再投放于该区域，可以在短时间内控制养殖水体致病菌的增殖，也可以长期抑制该水体病原菌的浓度，起到生态防御的效果。在养殖海水水体利用噬菌体防治病原菌引起的疾病，有高效、生态安全、简易持久的特点。

主权项

一种富集弧菌噬菌体与生物防制宿主菌的方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）按不同季节从养殖区的养殖池、进排水渠和海区的水体、养殖动物和其他底栖动物体内、浮游动物匀浆液以TCBS培养基分离弧菌菌株，春夏季5‑6月不少于100‑250株/100亩，秋冬季9‑10月不少于80‑150株/100亩，培养纯化菌株，保存于4℃备用；（2）在海区或养殖区内或一角建设5‑15m2，1‑1.5m深的水泥质或地膜或泥质小池，池底加入海沙2‑3cm，再加入新鲜过滤海水，养殖水源水，并保持水位不低于0.8～1m，小池的排水渠低于小池，使排出的水不回流，排水渠中设置60目、80目、120目多层筛绢过滤，再挂袋，内装含氯消毒剂，消毒1‑2d后才排放，使排出水的病原菌基本上被消灭，不扩散污染养殖区和海域，按照100‑150亩，设置此种小池10‑15个；（3）小池水体中保持异养菌、浮游植物的浓度适度：通过换水，适量投放低浓度大蒜素抑菌物质，保持异养菌冬夏季浓度在1～9×102‑3 cfu /mL范围，春秋季在1～9×103‑4 cfu /mL范围，适度投放生物肥和少量鱼粉、豆粉，培养浮游植物和浮游动物，并保持在中等偏下水平：浮游植物冬夏季1～5×102‑3 cfu /mL，春秋季1～5×103‑4 cfu /mL，浮游动物冬夏季1～5×101‑2 cfu /mL，春秋季1～5×102‑3 cfu /mL；采集养殖区域内的健康植食性小型鱼类、贝类和小型甲壳动物，用洁净海水暂养1周，其中消毒2次，清除携带弧菌；（4）分离保存备用的弧菌菌株投放水体，菌液终浓度为1～2×107‑8cfu/mL，浸泡养殖区域内的植食性小型鱼类、贝类和小型甲壳动物，时间为1h，然后投放于步骤（3）所述的小池，投放植食性小型鱼类：密度为每平米1‑2尾；小型贝类：每平米4‑10只；大型贝类：每平米2‑3只；浮游动物每平米100‑300只，按常规方法换水、培藻、适度增氧，监测水质指标；小池通过换水，适量投放低浓度大蒜素抑菌物质，保持水体弧菌冬夏季浓度在1～5×102‑3 cfu /mL范围，春秋季在1～5×103‑4 cfu /mL 范围，控制浮游生物按上述数量不变，长期养殖；（5）每半年采集海区和虾池健康贝类以及浮游动物，消毒清洗后，替换50%量的小池动物，保持步骤（4）中小池底栖生物和浮游动物基本数量不变，并长年保持小池浮游生物、底栖贝类和植食性小型鱼类生存数量，作为病原弧菌和噬菌体富集库；（6）每年3‑6月或者7‑11月采集小池水样、浮游生物匀浆液、对虾或其他底栖贝类内脏或肠道内容物匀浆液，将这些液体离心，过0.22mm膜滤，滤液中加入适量的500目沸石吸附，备用；（7）将步骤（1）的弧菌菌株加入蛋白胨水中，培养4‑6h，加入步骤（6）所述的沸石，观察6‑8h，取变清亮的培养瓶，用双平板法分离和纯化出噬菌体，再利用培养的宿主弧菌，扩大噬菌体数量，达到或超过1010～1011 cfu /mL，分离的噬菌体株不低于60～100株/年；（8）利用步骤（7）分离出的噬菌体，对步骤（4）小池的弧菌菌株鉴别，凡有噬菌体菌株，在小池没有相应宿主弧菌菌株，再向池中投放该菌株；步骤（7）的噬菌体投放适量海水中，终浓度为1×106～1×107 cfu /mL，投放步骤（4）小池底栖动物，浸泡1‑2h；（9）步骤（8）反复多次，浸泡间隔时间为15‑30d，直到可以在池中动物体内利用噬菌体技术分离到噬菌体菌株；（10）监测各种宿主菌及其噬菌体在养殖水体中的浓度变化，在某一种宿主菌浓度高于103～104cfu/mL，或其噬菌体浓度低于104 cfu /mL，再次按照步骤（8）投放噬菌体液体；（11）养殖池的养殖茬交替，季节交替时，将养殖池中的水放干，重新进水时，采集已经有噬菌体存在的养殖池的浮游动物，在检测无病菌和病毒病原的前提下，投放到转季或转茬的池塘水体，能够有效防止弧菌病产生。