一种激酶抑制剂对结肠癌细胞活性的检测方法

摘要

一种激酶抑制剂对结肠癌细胞活性的检测方法，主要从两个部分进行，第一部分，采用MTT比色法考察不同浓度的海绵来源化合物BA对肿瘤细胞增殖的影响筛选出对激酶抑制剂最敏感的癌细胞株；第二部分，建立肿瘤动物模型，考察激酶抑制的体内抗肿瘤活性，皮下接种建立裸鼠肿瘤模型，考察海绵来源化合物BA体内的抗肿瘤效应，并评价其体内的毒副作用。本发明评价方式周全，结论精确，可有效应用于临床。

主权项

1.一种激酶抑制剂对结肠癌细胞活性的检测方法，其特征在于，主要从两个部分进行，第一部分，筛选出对激酶抑制剂最敏感的癌细胞株；第二部分，建立肿瘤动物模型，考察激酶抑制的体内抗肿瘤活性；其中，在第一部分中，采用MTT法来研究激酶抑制剂对癌细胞株活性的影响，具体操作如下：1）培养细胞：采用含10%胎牛血清的培养基，于37℃、5%CO₂的培养箱中贴壁培养；2）接种细胞：用胰酶消化液消化，形成单细胞悬液，取一定量对数生长期SW620细胞、Hela细胞和A549细胞）接种于96孔板中，于37℃，5%CO₂的培养箱中培养，过夜；3）药物配制：将激酶抑制剂用DMSO溶解，配制含6.4×105 μmol/L激酶抑制剂作为母液，用细胞培养液稀释母液，最终配制浓度为0.5、1、2、4、8、16、32、64μmol/L的激酶抑制剂培养液，DMSO的最终含量≦0.1%；4）MTT溶液的配制：无菌条件下，在50ml离心管中加入20ml磷酸盐缓冲液，从中先吸取1ml磷酸盐缓冲液装入含MTT的小管中，使MTT尽量溶解，再转移到50ml离心管中，用纯净的磷酸盐缓冲液涮洗小管3次，将洗液混合后，定容到50ml，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，避光分装成1ml/管，并保存于-20度；5）药物干预：吸除96孔板中旧细胞培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2遍，添加含药物培养液干预细胞，同时设置阴性对照孔和调零孔，每个浓度设置6个复孔；6）分别培养24、48、72 h后，去除旧培养基，每孔添加200 μL不含血清的培养基和20μL MTT溶液，于37℃，5%CO²的培养箱中避光孵育4~6 h；7）小心吸除原液后，每孔添加150μL DMSO，摇床上轻摇10 min，ELx 800 NB酶标仪检测490 nm波长下的吸光值，计算抑制率与半数抑制浓度IC50，其计算公式为：其中，IC50值通过Excel模拟出趋势线，得到趋势线的公式，计算IC50值，以该浓度作为后续实验的干预浓度；而在第二部分中，采用激酶抑制剂对裸鼠结肠癌生长的抑制作用进行操作，采用的是皮下接种人结肠癌细胞悬液，直接建立结肠癌动物模型，具体操作步骤如下：1）复苏结肠癌细胞，采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，于37℃、5%CO₂的培养箱中贴壁培养；2）用胰酶消化液正常消化传代3-4次，取生长状态良好的细胞，胰酶消化，1000r/min离心5分钟，弃旧培基，收集细胞，采用无血清的培养基重悬细胞，Bio-Tek自动细胞计数仪计数，调整细胞浓度至3×10⁷～5×10⁷个/ml；3）于每只裸鼠右腋皮下接种0.1ml细胞悬液，每隔一天测量裸鼠的体重及肿瘤最长径和最短径，计算裸鼠的肿瘤体积大小；4）待肿瘤生长到100～150 mm³大小，随机将裸鼠分为4组，每组5只，连续5天给药，每天给药一次，常规饲养，饮水食物不限；5）每隔一天测量裸鼠的体重及肿瘤最长径和最短径，计算裸鼠的肿瘤体积大小，每天监测老鼠体重，并观察小鼠的行为活动和生命体征，包括肤色、大便、瘤体大小等，记录裸鼠的生存时间；6）实验结束，称体重，解剖裸鼠，PBS灌注，4%多聚甲醛固定，取裸鼠的肿瘤组织，称重，按照下面公式计算抑瘤率，评价标准：抑瘤率（%）<40为无效；抑瘤率（%）>40视为有效。