一种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法

摘要

本发明涉及一种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法，它是针对天津地区特有的番茄黄化曲叶病毒序列而构建了针对天津地区TYLCV的侵染性克隆，通过茎杆注射接种番茄黄化曲叶病毒，鉴定不同番茄材料对该病毒的抗性。此方法无需饲养烟粉虱、操作简单、效率高、重复性好、可控性好，能提供相对一致的接种压力，结果准确，是一种简便有效的接种鉴定方法。

主权项

1.一种鉴定天津地区番茄黄化曲叶病毒抗性的方法，其特征在于按如下的步骤进行：1）DNA 提取：从天津地区收集的发病植株的叶片中提取基因组总DNA；2）引物的设计：根据设计的简并引物，用于扩增该保守区的575bp的片段，引物序列分别为：CoPR，5’>GA(AGCT)G(GC)ATG(ACT)GT(AG)CA(AGT)GCCATATA<3’，AV494，5’>GCC（CT）AT（AG）TA（CT）AG（AG）AAGCC（AC）AG<3’，对该部分区域进行克隆及序列测序，BLAST 比较确定其是否为番茄黄化曲叶病毒分离物；根据已知片段的序列扩增未知的全长序列；设计构建含串联重复序列载体的引物，在设计引物时加入载体的酶切位点：克隆所用PCR引物：引物                                       引物序列(5’-3’)               BamHI上^a                              gtgggatccacttctaaatg                        BamHI下 ^a                           ggatcccatattgcaagacagactac      2356F^b                                    ggatggaaatgtgctgacct               BamR ^b                                    gtggatcccacatattgcaa                 F：上游引物；R：下游引物；a:扩增全长的DNA-A序列，下划线为BamHI酶切位点；b: 扩增0.4A的DNA-A序列，下划线为BamHI酶切位点；3）扩增产物克隆到pMD-19T载体上，分别命名为1.0A-pMD和0.4A-pMD并转化到DH5a菌液中；4）串联重复的克隆：用BamHI酶切切下1.0A-pMD的病毒全长DNA；用BamHI切开含有0.4A病毒基因组片段的0.4A-pMD载体；利用试剂盒回收相应大小的片段，利用T4连接酶将二者相连得到1.4A-pMD重组载体，转化至DH5a菌液中；5）正向串联重复序列的获得：1.0A和0.4A两个片段，利用引物C扩增阳性克隆菌液，比较大小后选出正向串联的菌落形成1.4A串联的克隆；所用引物为：PMD19F ^c        cgcc aag ctt gca tgccg              BamR ^c          gtggatcccacatattgcaa ；             6）表达载体的构建和转化：利用KnpI和SalI对含有1.4A番茄黄化曲叶病毒的1.4A-pMD质粒和植物表达载体pRI 101-An进行双酶切，然后利用T4连接酶将目的片段与表达载体进行连接得到1.4A- pRI，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中；用冻融法将1.4A- pRI直接转化农杆菌LBA4404的感受态细胞，转化后的菌液涂布于含利福平和卡那霉素平板，28℃温箱培养2～3d；挑取单菌落接种于2mL含50μg／mL利福平和100μg／mL卡那霉素的YEB培养基中培养过夜后，取1mL菌液置于1.5mL 离心管，离心收集菌体，加50μL无菌水煮沸10min，取上清作模板进行PCR扩增，扩增产物用1.0% 琼脂凝胶电泳验证；7）重组质粒的提取与鉴定：用50次量的TAKARAMiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0 试剂盒进行质粒DNA的微量提取，利用SalI和KnpI双酶切1.4A -pRI，37℃酶切消化1h后琼脂糖凝胶电泳检查结果；8）序列测定与分析：数据处理借助Lynnon Biosoft,QuebeCanada，DNAMAN Version 6.0进行，利用BLAST程序在GeneBank数据库中寻找与DNA-A序列最相近的基因组序列；9）农杆菌接种及病毒DNA的检测和田间调查：将含有病毒DNA-A侵染性克隆的农杆菌LBA4404分别接种在含50μg /mL卡那霉素和50μg /mL利福平的YEB液体培养基中，28℃，200 rpm振荡培养48 h，接种时，取一支1 mL的一次性注射器，吸取培养好的农杆菌菌液，在距离供试植株根部1-2 cm处取三点进行韧皮部注射，接种植株置于防虫温室中培养，在注射接种后30天，采集叶片约0.5克，抽DNA-A后进行PCR检测，对植株高度和叶片进行症状的观察。