CYP450酶亚型生物质谱绝对定量方法

摘要

本发明的CYP450酶亚型生物质谱绝对定量方法，属于蛋白质组学技术领域。本发明基于LC/MS/MS，利用CYP450经胰酶水解产生的特异性肽段定量酶的策略，实现了同时对肝微粒体等体系中4种CYP450酶亚型CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5的绝对定量。本发明主要包括如下步骤：蛋白样品预处理、标准曲线的制备、蛋白样品的测定以及质控样品的制备。本发明的方法线性关系良好、准确度高、重现性好而且灵敏、精密、可靠，可用于药物代谢及药物相互作用的评价。

主权项

1.一种CYP450酶亚型生物质谱绝对定量方法，涉及4种CYP450酶亚型CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5；具体步骤如下：A、蛋白样品预处理：(1)蛋白样品的还原，①于聚乙烯管中加入100μl蛋白样品，②加入5μl变性剂，涡流混匀，③加入10μ1还原剂，涡流混匀，④60℃孵育1小时，得到反应液；所述的变性剂，是重量体积比为20％的正-辛基谷氨酸溶液；所述的还原剂，是50mM的三(2-甲酰乙基)膦溶液；(2)半胱氨酸的封闭，于反应液中加入5μl半胱氨酸封闭剂，涡流混匀；室温孵育10min；所述的半胱氨酸封闭剂，是200mM的甲基甲烷硫代磺酸盐溶液；(3)蛋白样品的胰酶消化，经半胱氨酸封闭的反应液中加入100μl消化缓冲液，再加入10μl胰酶溶液，涡流混合，37℃孵育12～16小时得到蛋白样品反应液；所述的消化缓冲液，是0.1M的三羟甲基氨基甲烷与4mM氯化钙的混合溶液；所述的胰酶溶液，是5mg/ml的胰酶溶液；B、标准曲线制备：①利用肽段稀释液将稳定同位素标记肽段标准品溶解至500fmol/μl，得到稳定同位素标记肽段储备液；所述的肽段稀释液，是按体积百分数20％乙腈与0.1％三氟乙酸的混和溶液；②利用蛋白样品反应液将稳定同位素标记肽段储备液分别稀释至5、10、30、100、300fmol/μl；③取10μl进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，以稳定同位素标记肽段浓度为横坐标，稳定同位素标记肽段峰面积为纵坐标，用加权W＝1/x²最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为标准曲线；C、蛋白样品中CYP450酶亚型含量测定：取经由A步骤处理后的蛋白样品反应液10μl进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，将肽段峰面积代入标准曲线，求得肽段浓度；将相应3种肽段浓度取平均值，即为对应CYP450酶亚型浓度；经样品蛋白浓度校正，即将CYP450酶亚型浓度除以蛋白浓度，得到蛋白样品中CYP450酶亚型含量；所述的B步骤标准曲线制备及C步骤蛋白样品中CYP450酶亚型含量测定，色谱条件为：Agilent1100型液相色谱系统；色谱柱：peptide C18柱，50mm×2.1mm I.D.，5μm粒径；流动相：含体积百分数占0.1％甲酸的水和含体积百分数占0.1％甲酸的乙腈，梯度洗脱；柱温30℃；流速0.7ml/min；进样量10μl；质谱条件为：API4000型三重四极杆液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子化源和Analyst1.3数据处理软件；离子源：电喷雾离子化源；正离子方式检测；离子喷射电压4000V；温度550℃；源内气体1：氮气压力55psi；气体2：氮气压力60psi；气帘气体：氮气压力25psi；扫描方式为多重反应监测；各肽段离子对及其相应DP、CE以及CXP值见表1；表1肽段多重反应监测设定值其中，peptide代表肽段；light代表样品中正常肽段；heavy代表稳定同位素¹³C、¹⁵N标记肽段；所述的色谱条件中梯度洗脱程序见表2，表2梯度洗脱程序其中A是含体积百分数占0.1％甲酸的水，B是含体积百分数占0.1％甲酸的乙腈。