一种胞外生产重组α-环糊精葡萄糖基转移酶的生产方法

摘要

本发明公开了一种利用温度两阶段控制策略和恒溶氧补料分批技术高密度培养大肠杆菌生产重组α-环糊精葡萄糖基转移酶的发酵生产工艺，属于发酵工程技术领域。本发明采用重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)作为生产菌株，以5-10％的接种量接种后进行分批发酵，溶氧上升到80-100％左右，开始流加补料液，菌体进行指数生长，菌体生长阶段控制温度33-37℃，溶氧维持在20-30％；当菌体OD600达到15-30左右，添加0.75-1.5％(质量体积分数)甘氨酸；当菌体OD600达到45-60时，将温度降为23-27℃并连续补加0.2-0.4g·l-1·h-1乳糖，同时采用梯度递减的方式补加补料液；发酵培养30-35小时左右，胞外α-环糊精葡萄糖基转移酶的酶活达到200-280U/mL。采用此策略进行发酵实现了α-环糊精葡萄糖基转移酶的高效胞外表达，大大提高了生产强度。本发明原料来源广泛、工艺简单易行，适于大规模生产；有效的胞外表达，大大减少了宿主菌杂蛋白的污染，提高蛋白纯化效率。本发明为α-环糊精葡萄糖基转移酶的大规模生产奠定了基础。

主权项

一种生产重组α‑环糊精葡萄糖基转移酶的生产方法，其特征在于以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(pET‑20b(+)/cg)为出发菌株，其生产工艺如下：（1）分批发酵阶段：将种子培养液按5‑10%的接种量接入发酵培养基中，通过调节搅拌转速或者通入富氧空气的方式将溶氧维持在20‑30%，温度控制在33－37℃，流加质量浓度为25%的氨水控制pH6.5‑7.5，培养5‑6小时；所述发酵培养基的组成为：甘油8g/L，蛋白胨1g/L，酵母粉2g/L，KH2PO413.5g/L，(NH4)2HPO44g/L，柠檬酸1.7g/L，MgSO40.68g/L，微量元素液10mL/L，还含有浓度为100mg/L的氨苄青霉素；（2）补料培养阶段：分批发酵阶段结束后待溶氧上升至80‑100%，以指数流加的方式补加补料液控制菌体以0.2h‑1的比生长速率生长，通过提高搅拌转速或者通入富氧空气维持溶氧在20‑30%，温度控制在33－37℃，流加质量浓度为25%的氨水控制pH6.5‑7.5，当菌体OD600达到15‑30时一次性添加质量分数为0.75‑1.5%的甘氨酸；所述补料液为：甘油500g/L，MgSO4·7H2O20g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L；（3）诱导阶段：当菌体OD600达到45‑60时，将温度降为23‑27℃，诱导阶段以16‑20g·L‑1·h‑1为起始速率流加补料液，每3‑5h降低10‑20%的补料液流速，同时补加乳糖，乳糖流速控制在0.2‑0.4g·L‑1·h‑1，通过提高搅拌转速或者通入氧气维持溶氧在20‑30%，流加质量浓度为25%的氨水控制pH6.5‑7.5，诱导20小时。