一种将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法

摘要

一种将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法，将第一目标重组质粒电转化第一重组菌，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，得到第一目标菌，所述第一目标菌为一种重组绵羊李斯特菌，其基因组内orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能稳定表达和分泌外源基因编码蛋白；或将第二目标重组质粒电转化第二重组菌，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，得到第二目标菌，所述第二目标菌为一种重组绵羊李斯特菌，其基因组内无actA基因和plcB基因，且在其基因组内orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能稳定表达和分泌外源基因编码蛋白。

主权项

一种将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）将从含有拟整合外源基因的生物基因组模板或基因克隆质粒库内PCR扩增得到的上游带Hind Ⅲ酶切位点、下游带Xho I酶切位点的外源拟整合基因，插入第一重组质粒的Hind III酶切位点与Xho I酶切位点之间，得到中间重组质粒，所述第一重组质粒的基因序列为序列表中SEQ ID NO.1所示；（2）切下步骤（1）得到的中间重组质粒的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间的片段插入第二重组质粒的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间，得到第一目标重组质粒，所述第二重组质粒的基因序列为序列表中SEQ ID NO.2所示；或切下步骤（1）得到的中间重组质粒的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间的片段插入第三重组质粒的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间，得到第二目标重组质粒，所述第三重组质粒的基因序列为序列表中SEQ ID NO.3所示；（3）将步骤（2）得到的第一目标重组质粒电转化第一重组菌，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，得到第一目标菌，所述第一重组菌为一种重组绵羊李斯特菌，在其基因组orfBAldh基因上游整合入了β‑半乳糖苷酶基因，能表达β‑半乳糖苷酶，在含5‑溴‑4氯‑3‑吲哚‑β‑D‑半乳糖苷的培养基上长成蓝色菌落，所述第一目标菌为一种重组绵羊李斯特菌，其基因组内orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能稳定表达和分泌外源基因编码蛋白；或将步骤（2）得到的第二目标重组质粒电转化第二重组菌，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，得到第二目标菌，所述第二重组菌为一种重组绵羊李斯特菌，其基因组内无actA基因和plcB基因，且在其基因组orfBAldh基因上游整合入了β‑半乳糖苷酶基因，能表达β‑半乳糖苷酶，在含5‑溴‑4氯‑3‑吲哚‑β‑D‑半乳糖苷的培养基上长成蓝色菌落，所述第二目标菌为一种重组绵羊李斯特菌，其基因组内无actA基因和plcB基因，且在其基因组内orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能稳定表达和分泌外源基因编码蛋白。