一种柑橘全爪螨微卫星富集文库的构建方法

摘要

一种柑橘全爪螨微卫星富集文库的构建方法，采用磁珠富集法，集成已报道的微卫星位点筛选策略，通过基因组DNA提取、酶切、接头连接、磁珠富集及文库构建等一系列步骤，建立柑橘全爪螨微卫星富集文库。该方法将酶切和接头连接一步化，可成功构建柑橘全爪螨微卫星富集文库，微卫星阳性克隆率达从10%提高到30%以上。因此，本方法特别适合于开发柑橘全爪螨等微小昆虫及螨类的微卫星标记。此外，该方法简便易行，无污染，不需要特别的实验仪器，一般实验室均可成功开展。

主权项

一种柑橘全爪螨微卫星富集文库的构建方法，其特征在于，提取柑橘全爪螨高分子量的基因组DNA，采用Sau3AI或MseI进行酶切，酶切后，立即与特异性接头进行连接；PCR扩增检测酶切及接头连接是否成功，并选择性回收400‑700 bp的片段，然后进行磁珠富集；采用PCR扩增将富集的单链微卫星片段转换为双链DNA，并回收400‑700 bp的片段，最后转化大肠杆菌，构建成微卫星富集文库；菌落PCR检测富集文库的微卫星阳性克隆并测序，具体步骤如下：（1）采用CTAB即2% CTAB, 100 mM Tris‑HCl pH 8.0, 20 mM EDTA, 1.42 M NaCl, 0.2 % β‑巯基乙醇提取柑橘全爪螨高分子量的基因组DNA，采用Sau3AI或MseI在37℃下对基因组DNA进行酶切；（2）酶切片段在T4 DNA连接酶10 U/μL, Promega的作用下与特异性的人工接头进行连接，从而得到接头‑酶切DNA，PCR扩增检测酶切及接头连接是否成功，并选择性回收400‑700 bp的片段；（3）将标记有生物素的寡核苷酸探针与磁珠即10 mg/mL, Dynalbeads M‑280 Streptavidin, Invitrogen混合，形成探针‑磁珠混合物；探针‑磁珠与接头‑酶切DNA在55‑65℃下预杂交30 min，60‑70℃下杂交180 min，55‑68℃下洗脱10 min，最后将富集有微卫星的磁珠悬浮于50 μL的无菌双蒸水中；（4）以悬浮于双蒸水中的磁珠为模板进行PCR扩增，将单链DNA转变为双链；（5）PCR扩增产物采用凝胶回收试剂盒进行回收，回收产物溶于20 μL的双蒸水中；将微卫星富集产物经纯化后，与克隆载体连接，转化大肠杆菌，构建柑橘全爪螨微卫星富集文库；（6）将回收纯化的微卫星PCR富集产物与pGEM‑T Easy载体在22℃下连接1小时，转化大肠杆菌，构建柑橘全爪螨微卫星AC‑富集文库；（7）菌落PCR检测富集文库的微卫星阳性克隆并测序；步骤（2）所述的特异性的人工接头是指： Oligo A：5’‑GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG‑3’和Oligo B：5’‑ PO4‑GATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC‑3’或MseI‑A：5’‑TACTCAGGACTCAT‑3’和MseI‑B：5’‑GACGATGAGTCCTGAG‑3’步骤（3）所述的标记有生物素的寡核苷酸探针是指AC12或ATG8。