棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法及检测用引物

摘要

本发明公开了一种棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，包括如下步骤：首先提取颚口线虫DNA，同时进行棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫特异引物设计。然后，对设计的引物进行PCR反应条件的优化，确定最佳多重PCR模式。按照最佳多重PCR模式进行实验，验证各引物单一PCR特异性、多重PCR特异性、PCR敏感性和临床样本操作的可行性。此外，本发明还公开了用于同时检测棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的引物序列。通过各种验证表明本发明方法可以同时鉴定棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫，其快速、敏感、特异和同步鉴定3种颚口线虫的特点可应用于水产品颚口线虫的鉴定和检疫。

主权项

一种棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，所述方法不包括疾病诊断方法，其特征在于，具体步骤包括如下:①棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的虫体DNA提取；②引物设计与筛选；所述的引物设计与筛选具体为：应用分子生物学软件对颚口属线虫种间的ITS2基因序列进行比对分析，选择碱基差异较大的区域，在该范围设计棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫特异性引物，筛选确定引物，确保所设计引物必须为特异性引物，一对引物只能扩增出相应虫种的序列片段，并且与其它引物之间没有干扰，即没有同源、互补，不形成发卡结构；所述设计的引物序列为：棘颚口线虫的特异性引物：GS2‑F：5’‑GAGATGTCTAGCATCATCTCT‑3’（SEQ ID NO.1）；GS4‑R：5’‑ACTGTATCGGCGAAGCTG‑3’（SEQ ID NO.2）；杜氏颚口线虫的特异性引物：GD2‑F：5’‑AGATTTTGTTGCTGTTCGTT‑3’（SEQ ID NO.3）；GD3‑R：5’‑TATATACGGCCGCAGCTC‑3’（SEQ ID NO.4）；日本颚口线虫的特异性引物：GN1‑F：5’‑TCTACGACGACGAGAGGACT‑3’（SEQ ID NO.5）；GN5‑R：5’‑TGGAGTTGTCGATGTGTG‑3’（SEQ ID NO.6）；③对步骤②所设计的引物进行PCR反应条件优化，得到最佳多重PCR模式；④按照步骤③的最佳PCR反应条件进行单一PCR扩增特异性验证；⑤按照步骤③的最佳PCR反应条件进行多重PCR扩增特异性验证；⑥按照步骤③的最佳PCR反应条件进行PCR敏感性验证；⑦按照建立的多重PCR方法对临床虫种鉴定方法进行可行性验证。