主权项 |
一种海参体壁总DNA提取方法,其特征在于,包括以下步骤:(a)样品预处理:第一步是将海参的酒精保存样品用PBS溶液置换出酒精,或将海参干品用PBS溶液浸发,将第一步处理好的样品在高盐缓冲液中剪碎样品,然后固液分离,弃液相取剪碎的固体样品作为预处理后的样品;所述的高盐缓冲液为:200mmol/L Tris‑HCl,50mmol/L EDTA,500mmol/L NaCl,0.2%β‑巯基乙醇,余量为水,pH8.0;(b)样品的裂解:将预处理后的样品加入到裂解液中,再加入适量的蛋白酶K降解蛋白质,65℃消化30~60min,每隔5~10min混匀一次,待样品消化彻底后,12000g/min离心2~3min,上层形成一层悬浮粘稠物,取下层澄清的样品消化液;所述的裂解液为100mmol/LTris‑HCl,20mmol/L EDTA,1.4mol/L NaCl,2%CTAB,1%PVP,1%SDS,0.2%β‑巯基乙醇,余量为水;(c)样品消化液用氯仿:异戊醇抽提,含有DNA的水相加入等体积的异丙醇高盐溶液,‑20℃下放置20min,12000‑13000g/min离心12‑15min,弃上清,取DNA沉淀;所述的异丙醇高盐溶液是由异丙醇和5mol/L NaCl按体积比3:1混合而成;(d)用体积分数70%乙醇水溶液的洗涤DNA沉淀,然后12000‑13000g/min离心3‑5min,弃上清;重复操作2‑3次,将DNA沉淀干燥,再用0.1×TE溶液充分溶解保存。 |