一种鲜动物药药物组合物及其原料药的含量测定方法

摘要

本发明公开一种鲜动物药药物组合物及其原料药的含量测定方法，该方法为：取本发明鲜动物药药物组合物和原料药，置于量瓶中，加水溶解，超声提取，离心，取上清液，过微孔滤膜，得游离氨基酸供试品溶液；称取本发明鲜动物药药物组合物和原料药，加水充分溶解后，超声提取，离心，取上清液，置于安剖瓶中，加入盐酸，真空充氮，水解，取出，放冷至室温，加入NaOH溶液，混匀，转移至量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混匀，离心，取上清液，过微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶液。以色谱柱检测一级氨基酸和二级氨基酸。以乙腈：甲醇：水为流动相A，pH为7.8的Na2HPO4为流动相B，进行梯度洗脱。本发明方法操作简单，分辨率高、灵敏度高，并可在短时间内分离鲜动物药药物组合物及其原料药中12～26种氨基酸，是一种可靠的氨基酸含量测定方法。

主权项

一种药物组合物的含量测定方法，其特征在该方法为包括如下步骤：(1)标准品溶液的制备a、0.1 mol/L盐酸溶液取36%‑38%的浓盐酸0.83体积份于100体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度；b、系列浓度17种氨基酸混合标准品溶液 17种氨基酸分别：天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸；取17种氨基酸混合标准品溶液25µL、50µL、100µL、200µL、400µL、800µL于0.5‑1.5体积份容量瓶中，以0.1 mol/L盐酸水溶液稀释并定容至刻度，得25‑1000pmol/µL系列浓度的氨基酸混合标准品溶液；c、1%苯酚的6mol/L盐酸溶液取苯酚0.2‑0.8重量份于30‑70体积份棕色量瓶中，加入浓盐酸15‑35体积份，加水溶解并定容至刻度；d、10 mol/L NaOH溶液取NaOH 10‑30重量份，置于30‑70体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度，混匀，转移至塑料储瓶中备用；e、40 mol/L Na2HPO4缓冲液取NaH2PO4  3‑8重量份，加水溶解并定容于500‑1500体积份量瓶中，用10 mol/L NaOH溶液调节pH值至7.8，混匀，即得；(2)供试品溶液的制备a、游离氨基酸供试品溶液的制备称取药物组合物0.05‑0.15重量份，置于25‑75体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度，超声提取15‑45分钟，离心5‑15分钟，取上清液，过0.3‑0.6µm微孔滤膜，得游离氨基酸供试品溶液；b、总氨基酸供试品溶液的制备称取药物组合物0.05‑0.15重量份，置于10‑20体积份塑料离心管中，加水5‑15体积份充分溶解后，超声提取15‑45分钟，离心5‑15分钟，取上清液，取0.05‑1.5体积份上清液，置于安剖瓶中，加入含1%苯酚的6mol/L盐酸2‑6体积份，真空充氮N2 15‑45 秒，迅速密封，置于80‑150℃恒温干燥箱内水解12‑32小时，取出，放冷至室温，加入1.2‑3.6 体积份 10 mol/L NaOH溶液，混匀，转移至5‑15体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混匀，离心5‑15分钟，取上清液，过0.45µm微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶液；(3)色谱条件色谱柱：4.6×150mm，3.5µm  Zorbax Eclipse‑AAA柱，流速：1.5ml/min，柱温为35℃，自动进样程序，紫外检测器于338nm处检测一级氨基酸，于262nm波长处检测二级氨基酸；以乙腈：甲醇：水=25‑65:25‑65:5‑15为流动相A，pH 为7.8的40mmol/L Na2HPO4为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0‑2.5min 流动相A为0%，流动相B为100%；2.5‑16min 流动相A为30%，流动相B为70%；16‑24min 流动相A为57%，流动相B为43%；24‑24.8min 流动相A 为100%，流动相B为0%；24.8‑29.7min 流动相A 为100%，流动相B为0%；29.7‑30.9min 流动相A为0%，流动相B为100%；30.9‑34.7min 流动相A为0%，流动相B为100%；(4)测定结果所述药物组合物中检测到14种氨基酸，其中总蛋白质的含量为1.9%‑2.85%，总游离氨基酸的含量为12.52%‑18.78%，总氨基酸的含量为14.41%‑21.62%；所述药物组合物的原料药组成为：鲜守宫700‑2300重量份       鲜金钱白花蛇400‑1100重量份鲜蕲蛇400‑1100重量份。