靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系的建立方法

摘要

本发明公开了一种靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系的构建方法，设计能有效阻止猪蓝耳病病毒增殖和复制的靶向基因shRNA，并通过转座子载体插入供体细胞的基因组，从而获得能有效阻止蓝耳病病毒感染的克隆细胞系。本发明还同时公开了重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA的构建方法，包括设计靶向基因shRNA--ORF6-6e，通过PCR扩增zsGFP和NEO片段，将ORF6-6e的shRNA酶切连接到pMD18-T Simple载体上，并通过酶切，回收、连接到PXL-BAC2载体上。本发明还同时公开了该转基因细胞系的用途：对PRRSV型病毒具有抑制作用。

主权项

重组载体PXL‑BAC2‑FRT‑EGFP‑NEO‑shRNA的构建方法，其特征在于包括以下步骤：1）、设计靶向基因shRNA：ORF6‑6e：5'‑gatccGCCATAGAAACCTGGAAGTTTCAAGAGAACTTCCAGGTTTCTATGGCTTTTTTg‑‑‑‑‑3'3'‑‑‑‑‑gCGGTATCTTTGGACCTTCAAAGTTCTCTTGAAGGTCCAAAGATACCGAAAAAActtaa‑5'；2）、构建重组载体PXL‑BAC2‑FRT‑EGFP‑NEO‑shRNA：通过PCR扩增zsGFP和NEO片段，将ORF6‑6e 所述的shRNA酶切（EcoRI‑BamHI）连接到pMD18‑T Simple载体上，并通过BglII‑EcoRV酶切，回收、连接到PXL‑BAC2载体上， 构建了重组载体PXL‑BAC2‑FRT‑EGFP‑NEO‑shRNA。