发明名称 |
甘蔗赤条病菌巢式PCR检测方法 |
摘要 |
本发明涉及一种甘蔗赤条病菌(Acidovoraxavenaesubsp.avenae)的巢式PCR检测方法,以感病的甘蔗叶片DNA为模板,根据甘蔗赤条病菌的16SrRNA核苷酸序列设计的特异性引物SRSD-16S-F1和SRSD-R2、SRSDF1和SRSDR1,采用巢式PCR扩增方法,检测甘蔗赤条病菌。本发明的甘蔗赤条病菌巢式PCR检测方法,克服了生物学鉴定、电镜技术、酶联免疫技术、常规PCR等方法的缺点,提供了一种快速、特异、灵敏的甘蔗赤条病菌的检测方法。 |
申请公布号 |
CN102864244A |
申请公布日期 |
2013.01.09 |
申请号 |
CN201210392025.1 |
申请日期 |
2012.10.16 |
申请人 |
福建农林大学 |
发明人 |
高三基;黄莺英;陈如凯;傅华英;林艺华;付为林;陈平华;王恒波 |
分类号 |
C12Q1/68(2006.01)I;C12Q1/04(2006.01)I;C12R1/01(2006.01)N |
主分类号 |
C12Q1/68(2006.01)I |
代理机构 |
福州元创专利商标代理有限公司 35100 |
代理人 |
蔡学俊 |
主权项 |
一种甘蔗赤条病菌巢式PCR检测方法,包括甘蔗叶片DNA提取、引物设计、第1轮PCR扩增、第2轮PCR扩增和电泳检测;其特征在于:(1)引物设计:扩增甘蔗赤条病菌(Acidovorax avenae subsp. avenae)的引物SRSD‑16S‑F1和SRSD‑R2、SRSD‑F1和SRSD‑R1的序列如下: SRSD‑16S‑F1:5’‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3’ SRSD‑R2:5’‑TGTCAAAGGTGGGTAAGGTT‑3’;SRSD‑F1:5’‑ACGGTAACAGGTCTTCGGA‑3’SRSD‑R1:5’‑CAGTTGACATCGTTTAGGGC‑3’; (2)第1轮PCR扩增:PCR扩增体系为总体积50 μL,内含5.0 μL 10×PCR 缓冲液,4.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs,10 μmol/L引物SRSD‑16S‑F1和SRSD‑R2各2.0 μL,0.25 U Taq DNA Polymerase,500 ng甘蔗叶片基因组DNA,ddH2O补足到50 μL; PCR扩增程序如下:94 ℃预变性3 min、94 ℃变性45 S、55~60 ℃退火30 S、72 ℃延伸60 S,共30~35个循环,最后72 ℃再延伸7 min;所述10×PCR缓冲液组成成分为500 mmol/L KCl,100 mmol/L Tris‑HCl (pH 8.3),15 mmol/L MgCl2; (3)第2轮PCR扩增: PCR扩增体系为总体积50 μL,内含5.0 μL 10×PCR 缓冲液,4.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs,10μmol/L引物SRSD‑F1和SRSD‑R1各2.0 μL,0.25 U Taq DNA Polymerase,第一轮PCR产物稀释100倍后取1.0 μL,ddH2O补足到50 μL;PCR扩增程序如下:94 ℃预变性3 min、94 ℃变性45 S、53~57 ℃退火30 S、72 ℃延伸45 S,共30~35个循环,最后72 ℃再延伸7 min; (4)电泳检测:出现一条分子量为755 bp的核酸带的样品,为感染甘蔗赤条病菌的植株叶片样品。 |
地址 |
350002 福建省福州市仓山区建新镇金山学区 |