一种RNA的预备模板PCR检测方法

摘要

本发明提供了一种RNA的预备模板PCR（Template-Ready PCR，TRPCR）检测方法。本发明方法与采用传统的RT-PCR方法相比，不需要纯化抽提RNA，不需要进行逆转录反应，将原本长达3个小时以上的PCR前处理过程缩短为约50分钟，因此，操作简便快速易行，具有较高的RNA检测的灵敏度和特异性，适合对各种来源的样品裂解得到RNA进行检测。

主权项

一种RNA的预备模板PCR检测方法，所述方法包括：（1）设计与目标RNA上任意一段序列互补的长度为25~40mer的单链寡核苷酸DNA，记为探针A；探针A的GC含量为40~60%，解链温度为70~85℃；将探针A锚定在PCR管内，得到锚定PCR管；（2）设计部分序列与目标RNA上另一段任意序列互补的单链寡核苷酸DNA，其结构为: 两端是特异的长度为20~30mer的PCR引物序列、中间为与目标RNA互补的长度为25~40mer的序列，记为探针B；探针B 的GC含量为40~60%，解链温度为70~85℃，与探针A和目标RNA的结合区域互不重叠；（3）取待测样本，加入探针B和含表面活性剂的细胞裂解液，反复吸打，转移至离心管中，冰上放置20min，4℃离心，取上清液，得到裂解上清液；（4）取裂解上清液20uL至锚定PCR管中，60~70℃保温5~15min，吸干管内液体，以洗涤液洗涤3~9次，吸干，加入20uL 由PCR缓冲液和PCR引物配制的PCR反应液，进行PCR扩增，扩增产物进行荧光定量分析；（5）以空白裂解液作为阴性对照，按照步骤（1）和（2）方法进行处理和分析，以样本Ct值小于空白裂解液Ct值判断为阳性。