金黄色葡萄球菌荚膜多糖和蛋白质偶联物及制备方法和用途

摘要

本发明公开了一种金黄色葡萄球菌荚膜多糖和蛋白质偶联物及制备方法和用途。以鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白或聚赖氨酸鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白为载体，将金黄色葡萄球菌荚膜多糖经过化学修饰后和载体蛋白进行化学偶联。由于鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白和聚赖氨酸鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白具有免疫佐剂功能，新形成的偶联物可以使免疫原性很低的金黄色葡萄球菌荚膜多糖获得较高的免疫原性，并在免疫注射时载体蛋白发挥免疫佐剂作用，使被免疫动物产生针对金黄色葡萄球菌荚膜多糖的特异性免疫反应增强。本发明在抗金黄色葡萄球菌感染的疫苗制备方面具有广泛的用途。

主权项

一种金黄色葡萄球菌荚膜多糖和蛋白质偶联物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)聚赖氨酸鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的制备通过重叠延伸PCR法在鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因的上游引入6个连续编码的赖氨酸密码子，所述6个连续编码的赖氨酸密码子的序列为：AAAAAGAAAAAGAAAAAG，该连接了6个赖氨酸密码子的鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因序列被引入载体pET‑His后，获得表达载体pET‑His‑6×Lys‑Flic，并转化至大肠杆菌，得到表达聚赖氨酸鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的工程菌，目的蛋白的表达量达到细菌总蛋白的15～25％；(2)金黄色葡萄球菌荚膜多糖的化学修饰将金黄色葡萄球菌荚膜多糖配成4～6mg/ml的生理盐水溶液，在每毫升该溶液中，加入己二酸二酰肼0.03～0.07g，混匀，在每毫升该溶液中，加入1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基‑丙基)‑碳化二亚胺0.005～0.02g，混匀，用盐酸溶液调节该溶液的pH值至3.7～5.6，在室温下置2～4小时；(3)去除未被结合的己二酸二酰肼和1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基‑丙基)‑碳化二亚胺将上述反应物装于透析袋中，截止分子量为5KD～10KD，在0.2M的NaCl溶液中于4℃透析1～2小时，以除去己二酸二酰肼和1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基‑丙基)‑碳化二亚胺；(4)荚膜多糖和蛋白载体的偶联在每毫升上述经过化学修饰的荚膜多糖溶液中加入鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白或者聚赖氨酸鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白0.5～2mg，震荡混匀，用盐酸调节混合物溶液的pH值至3.7～5.6，然后在每毫升溶液中加入0.001～0.004g 1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基‑丙基)‑碳化二亚胺，震荡混匀，用盐酸溶液再次调节pH值至3.7～5.6，放置4℃反应10～14小时；(5)偶联物的收集和纯化将偶联物原液经10000～20000rpm离心2分钟，取上清过凝胶柱，采用蛋白纯化系统在206nm和280nm处收集洗脱液，用生理盐水平衡与洗脱凝胶柱，柱子的平衡和洗脱流速为2～4ml/分。