改进的大范围核酸酶重组系统

摘要

本发明涉及一组遗传构建体，其至少包含第一致重组构建体(i)和第二构建体(ii、iii或iv)，所述第一致重组构建体(i)具有至少两个与位点特异性内切核酸酶的DNA靶标位点之前和之后的基因组区域同源的部分，并且还包含插入所述同源部分的阴性选择标记和阳性选择标记以及其中可将目的序列克隆到邻近阳性选择标记的区域；所述第二构建体(ii、iii或iv)包含大范围核酸酶。本发明还涉及包含这些构建体的试剂盒以及使用该组构建体将目的序列引入到靶细胞、组织或生物体之基因组中的方法。

主权项

一组遗传构建体，其包含：a)构建体(i)，其由至少包含以下组分的核酸分子所编码：(N)n‑HOMO1‑P‑M‑HOMO2‑(N)m(i)其中，n和m为整数并且代表0或1，前提是当n＝1时m＝0而当n＝0时m＝1；因此组分N可被设置在HOMO1之前或HOMO2之后，并且组分P和M可按顺序P‑M或M‑P设置；其中N包含组分(PROM1)‑(NEG)‑(TERM1)；P包含组分(PROM2)‑(POS)‑(TERM2)；并且M包含组分(PROM3)‑(MCS)‑(TERM3)；以及其中PROM1为第一转录启动序列；NEG为阴性选择标记；TERM1为第一转录终止序列；HOMO1为与核酸酶DNA靶序列之前的基因组部分同源的部分；PROM2为第二转录启动序列；POS为阳性选择标记；TERM2为第二转录终止序列；PROM3为第三转录启动序列；MCS为多克隆位点；TERM3为第三转录终止序列；HOMO2为与所述核酸酶DNA靶序列之后的基因组部分同源的部分；b)至少一种选自包括构建体(ii)或(iii)在内的组的构建体，所述构建体(ii)或(iii)由至少包含以下组分的核酸分子所编码：PROM4‑NUC1(ii)；NUC2(iii)；或所述组还包含序列(iv)，其为至少包含以下组分的分离或重组蛋白质：NUC3(iv)；其中PROM4为第四转录启动序列；NUC1为大范围核酸酶、TALEN或ZFN的开放读码框(ORF)；MEGA2为所述大范围核酸酶、所述TALEN或所述ZFN的信使RNA(mRNA)形式；MEGA3为所述大范围核酸酶、所述TALEN或所述ZFN的分离或重组蛋白质；其中来自构建体(ii)或(iii)或者序列(iv)的所述大范围核酸酶、所述TALEN或所述ZFN识别并切割所述核酸酶DNA靶序列；并且其中构建体(ii)或(iii)或者序列(iv)被设置成与构建体(i)共转染到至少一种靶细胞中。