水稻人工miRNA基因干涉载体快速构建方法

摘要

本发明涉及水稻人工miRNA基因干涉载体快速构建方法，尤其涉及水稻快速沉默载体改造用DNA序列和该DNA序列的合成方法以及采用该DNA序列用于建立高效的水稻人工miRNA基因干涉载体。本发明将沉默相关片段两端的不变区域事先放入转基因目标载体，再将核心沉默片段(wi-site)连入改造后的载体，直接完成载体构建。在首、尾片段选择时，分析了DNA序列，使得首尾片段相连后可获得一个AfeI酶切位点，转化大肠杆菌后，可大量制备该载体并用AfeI内切酶对其进行线性化，直接连接采用本专利方法合成的核心沉默片段，完成水稻沉默载体的构建。本发明扩展了目标载体上不变的DNA区间，从而简化了单个沉默载体构建的方法，加速了构建过程，提高了载体构建的效率。

主权项

水稻快速沉默载体改造用DNA序列的合成方法，其特征在于，该方法采用水稻Os‑amiR528DNA基因干涉序列，所述的水稻Os‑amiR528DNA基因干涉序列如SEQ ID NO：3所示，将水稻Os‑amiR528DNA基因干涉序列分成首片段、尾片段和核心沉默片段，首片段的序列如SEQ ID NO：5所示，尾片段的序列如SEQ ID NO：6所示；在首片段的前端和尾片段的尾端设计了酶切位点及相应的保护碱基；将首片段、尾片段拼接获得一个包含AfeI酶切位点的如SEQ ID NO：2所示的沉默载体改造用DNA序列，其中首片段由AGC位点结尾，而尾片段由GCT位起始，其中SEQ ID NO：2所述如下：tcGAGCTCcagcagcagccacagcaaaatttggtttgggataggtaggtgttatgttaggtctggttttttggctgtagcagcAGCGCTgctaggctgttctgtggaagtttgcagagtttatattatgggtttaatcgtccatggcatcagcatcagcagcGGTACCga；其中，tcGAGCTC和GGTACCga部分为克隆位点和保护碱基，AGCGCT部分为AfeI酶切位点。