一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法

摘要

本发明公开了一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法使用预先设计的细胞膜蛋白和细胞壁合成酶基因的双敲除基因的引物进行PCR反应，得到两端为10～250bp特定目标基因同源序列及中间为抗性标记序列的双敲除基因的基因打靶片段，并分别通过电转化整合到宿主大肠杆菌染色体中，得到双基因突变的分泌型大肠杆菌菌株。本发明提高重组外源蛋白的表达，降低目标蛋白的胞内降解；减少重组外源蛋白的胞内积累，消除了包涵体的形成；取消了细胞破壁工艺，降低了热原，简化了分离纯化；进而达到降低生产成本，提高蛋白表达和产品质量的目的。

主权项

一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法，其特征在于：使用预先设计的细胞膜蛋白和细胞壁合成酶基因pal 和mrcB，或mrcB和lpp 的双敲除基因或其他基因组合的双敲除基因的引物进行PCR反应，得到两端为10～250 bp特定目标基因同源序列及中间为抗性标记序列的浓度为1～1000 ng/µl的pal 和mrcB，或mrcB和lpp 的双敲除基因或其它基因组合的双敲除基因的基因打靶片段，并分别通过电转化整合到宿主大肠杆菌染色体中，得到双基因突变的分泌型大肠杆菌菌株；所述的其他基因组合指的是mrcA，mrdA，rodA，murC，rodZ中任意两个的组合。