发根农杆菌介导的花生根诱导体系的建立方法及其应用

摘要

本发明涉及“发根农杆菌介导的花生根诱导体系的建立方法及其应用”属于生物技术领域。本发明采用发根农杆菌并利用微量注射方法诱导花生根系，得到了嵌合植株，同时对该体系的方法，进行了优化，以上胚轴为外植体微量注射方式侵染花生的方法，最大的转化效率为61％，同时验证了经密码子优化的cry8Ea1和cry8Ha1基因对暗黑鳃金龟幼虫的生物活性。本发明成功建立了花生根诱导体系，为外源基因导出花生植株，提供了快速验证方法，为进一步得到转基因花生植株提供了技术支持。

主权项

发根农杆菌介导的花生根诱导体系的建立方法的应用，其特征在于所述发根农杆菌中含有外源基因载体，菌种活化时的培养基中还含有载体所带的相应抗生素，所述外源基因载体中的基因为经密码子优化的cry8Ea1或cry8Ha1,其核苷酸序列如SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示；所述外源基因载体中基因的上游添加了Ω序列、Kozak序列，下游添加了内质网定位信号，所述外源基因载体中添加了上述序列的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示；骨架载体为插入了两个MAR序列的基础载体pCAMBIA2300；cry8Ea1或cry8Ha1基因由组成型启动子35S驱动，所述发根农杆菌介导的花生根诱导体系的建立方法包括如下步骤：（1）活化菌种，将发根农杆菌在含有链霉素、利福平的LB固体培养基上划线培养，长出单菌落，挑取单菌落在含有链霉素、利福平的LB液体培养基中220rpm，30℃培养至OD600=0.2‑0.8，（2）微量注射，取发根农杆菌对花生外植体上胚轴微量注射，接种量为1×107‑5×107；（3）接菌的外植体放置到含有乙酰丁香酮的共培养基上培养1‑3天，乙酰丁香酮的含量为5μmol l‑1‑100μmol l‑1；（4）转移到继代培养基上，培养6‑25天，所述发根农杆菌的菌株为发根农杆菌K599，所述共培养基和继代培养基为MS基础培养基。