半巢式-RT-Realtime PCR检测马铃薯X病毒的试剂盒

摘要

本发明公开了半巢式-RT-Realtime PCR检测马铃薯X病毒的试剂盒，包括TaqMan探针与引物的设计、植物总RNA提取及质量控制、将RNA反转录合成cDNA和实时荧光PCR检测。本方法有机地结合了实时荧光PCR和巢式PCR技术：在实时荧光PCR引物的外侧按照巢式PCR的设计原理增设了一条正链引物，反链引物分别与两条正链引物配对形成两套独立的PCR反应，并共用一条TaqMan探针。本发明的优点在于：引物极高的扩增效率保证了检测的高灵敏度，有效提高了检测的灵敏度，三条引物形成的两套PCR体系进行相互验证，极大地提高了检测的准确性，简化了操作并缩短了检测周期，全封闭的操作系统减少了污染。

主权项

半巢式‑RT‑Realtime PCR检测马铃薯X病毒的方法，其特征在于包括以下步骤：根据马铃薯X病毒全基因组中外壳蛋白基因序列保守区，设计三条引物和一条TaqMan探针；(1)从植物叶片中提取总RNA并测定其OD值；(2)将提取的植物总RNA反转录合成cDNA；(3)实时荧光PCR检测，包括引物探针的特异性检测和灵敏度检测；所述的三条引物和一条TaqMan探针，其中一条上游引物序列为：5’‑TGCCCAAACTGCTGCCTT‑3’；另一条上游引物序列为：5’‑GGCCAGGGCACAATCCA‑3’；下游引物序列为：5’‑CAGTGATACGACCTCGAGTGACA‑3’；探针序列为：5’FAM‑CGACTTTGCCAGCCTAGATGCAG‑3’TAMRA。