在大肠杆菌中嵌膜表达和纯化水通道蛋白AqpZ的方法

摘要

本发明公开了一种在大肠杆菌中嵌膜表达和纯化水通道蛋白AqpZ的方法，该方法首先扩增大肠杆菌水通道蛋白AqpZ-HIS，然后构建重组表达载体并构建及诱导表达工程菌株，超声波破碎得到的融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的菌体，最后纯化得到水通道蛋白AqpZ；本发明实现了在大肠杆菌中高效表达麦芽糖结合蛋白-水通道蛋白AqpZ-多聚组氨酸二元标签融合蛋白，克服了传统超表达AqpZ对宿主细胞造成的毒性及形成不溶性包涵体问题；而且，通过本方法表达的水通道蛋白只需通过两轮的简单的亲和色谱分离就可以得到高纯度的水通道蛋白AqpZ，操作简单可适用于工业化生产。

主权项

一种大肠杆菌中嵌膜表达和纯化水通道蛋白AqpZ的方法，其特征在于，它包括以下步骤：（1）大肠杆菌水通道蛋白AqpZ‑HIS的扩增：根据NCBI上的大肠杆菌水通道蛋白基因序列设计2对引物，通过设计引物在AqpZ基因的3'端人为的添加8个HIS亲和标签，第一引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，第一引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，第二引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，第二引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；根据pMAL‑p2和pMAL‑c5e这两个载体的多克隆位点特点，在第一引物的上下游分别加上Bam HI和Sal I限制性内切酶位点以适用于pMAL‑p2，在第二引物的上下游分别加上Bam HI和Hind III限制性内切酶位点以适用于pMAL‑c5e，利用聚合酶链式反应，得到带组氨酸标签的水通道蛋白AqpZ‑HIS的DNA（2）重组表达载体的构建：将步骤1得到的带组氨酸标签的水通道蛋白AqpZ‑HIS的DNA定向克隆到用同样的内切酶双酶切过的表达载体pMAL‑p2和pMAL‑c5e上，得到含有水通道蛋白AqpZ的二元标签重组表达载体pMAL‑p2‑AqpZ‑HIS及 pMAL‑c5e‑AqpZ‑HIS；将这两个二元标签重组表达载体化到大肠杆菌DH5α感受态中，然后，涂布在含氨苄霉素的LB平板上，培养过夜，随机挑取平板上生长的菌落，碱法抽提质粒DNA，进行双酶切和测序鉴定；（3）工程菌株的构建及诱导表达：将步骤2鉴定正确的的质粒转化到大肠杆菌表达宿主Rosetta (DE3)中，并接种到含有100 μg/mL 氨苄霉素和34 μg/mL 氯霉素的LB培养基中，在200‑250转/分钟转速、30℃下培养过夜，得到种子液；然后，把种子液接种到SOC培养基摇瓶中，种子液与SOC培养基的体积比为l:50，在200‑250转/分钟转速、30℃下培养至OD600为1.5时加入IPTG至IPTG的摩尔浓度为0.6 mM，并继续诱导培养8小时，然后5000转/分钟离心10分钟收集菌体，即得到超表达水通道蛋白融合蛋白MBP‑AqpZ‑HIS的菌体；（4）超声波破碎步骤3得到的融合蛋白MBP‑AqpZ‑HIS的菌体，12000转/分钟离心10分钟后收集上清；（5）纯化步骤4收集的上清，得到水通道蛋白AqpZ。