一种鸭病毒性肝炎精制异源卵黄抗体的制备方法

摘要

本发明提供了一种鸭病毒性肝炎精制异源卵黄抗体的制备方法，具体步骤为：(1)分离高免鸡蛋蛋黄；(2)提取卵黄抗体；(3)配制制剂及包装；所述鸭病毒性肝炎精制异源卵黄抗体的制备方法，不仅易于操作，适合大规模生产，且制备的鸭病毒性肝炎卵黄抗体性质稳定、纯度高、效价高、特异性较强，无药残，温和环保，对预防鸭病毒性肝炎的预防及治疗极具应用价值，为鸭病毒性肝炎精制异源卵黄抗体的制备提供了新的思路。

主权项

一种鸭病毒性肝炎精制异源卵黄抗体的制备方法，其特征在于：具体步骤为：（1）分离高免鸡蛋蛋黄：收集高免鸡蛋用70%（V/V）的乙醇进行蛋壳表面消毒，晾干后送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离，所述高免鸡蛋是由以下方法获得的：①使用禽类专用抗菌肽饲料添加剂连续饲喂健康产蛋鸡；②制备免疫用油乳剂抗原：a：将冷冻保存的鸭肝炎病毒AV2111毒种稀释后接种10‑11日龄SPF鸡胚并收集死亡鸡胚，收集胚体病变明显的鸡胚尿囊液；b：将步骤a收集的尿囊液加入终浓度为0.1%的福尔马林密封灭活，取灭活后的尿囊液与无菌吐温‑80以19：1（W/W）的比例混合后制成水相；取白油、司本、硬脂酸铝以93：5：2（W/W/W）的比例混合，搅拌均匀后，高压灭菌20分钟制成油相；c：将步骤b所制备的水相和油相以5：2（V/V）的比例混合，乳化制成免疫用油乳剂抗原；③免疫产蛋鸡，制备高免鸡蛋：将步骤②所制备的油乳剂抗原免疫步骤①处理过的产蛋鸡，免疫方式为皮下注射，剂量为1毫升/只，免疫次数为3次，第1次与第2次免疫间隔10天，第2次与第3次免疫间隔14天，将上述经过3次免疫后的产蛋鸡正常饲喂七天后收集鸡蛋，即为高免鸡蛋；（2）提取卵黄抗体：A：将步骤（1）所收集的蛋黄与无菌水1：1（V/V）混合后搅拌均匀，65℃密封灭活10分钟后迅速冷却至8℃‑12℃，然后与无菌水以1：4的比例混合（V/V），1M的HCl调节pH至5.2，充分搅匀后4℃静置6小时，5000rpm离心20分钟，取上清；B：将步骤A所得上清液与饱和硫酸铵溶液以1：1（V/V）的比例混合，4℃静置12小时，8000rpm离心20分钟，取沉淀；按质量比为1：3的比例将沉淀用无菌水溶解，所得溶液和饱和硫酸铵溶液以2：1（V/V）的比例混合，4℃静置12小时，8000rpm离心20 分钟，取沉淀，按质量比为1：3的比例将沉淀用0.01M pH7.2的无菌PBS溶解；C：将步骤B所得溶解液用截留量为100ku的超滤膜除盐浓缩；D：将40%(V/V)的甲醛溶液与步骤C所得浓缩液混合,使甲醛的终浓度达到0.1%（V/V）；充分搅拌均匀后密封2小时；然后用0.45微米和0.22微米的微孔滤膜分别过滤，取滤液4℃保存备用；（3）配制制剂及包装：将步骤（2）所得滤液进行鸭病毒性肝炎抗体效价测定，用0.01M pH7.2的无菌PBS稀释至中和抗体效价为1：512；然后加入吐温80，至吐温80终浓度为0.01%（V/V）作为保护剂，搅拌均匀后无菌条件下分装成成品。