含组氨酸标签重组人内皮抑素质谱绝对定量方法

摘要

本发明的含组氨酸标签重组人内皮抑素质谱绝对定量方法，属于分析技术领域。本发明基于LC-MS/MS，利用Ni2+琼脂糖凝胶树脂提取血浆样品中的含组氨酸标签重组人内皮抑素，并利用重组人内皮抑素经胰蛋白酶水解产生的特异性肽段定量策略，以一段与特异性肽段序列相似的合成肽段为内标，实现了对血浆样品中含组氨酸标签重组人内皮抑素的绝对定量。本发明主要包括生物样品制备方法、LC-MS/MS测定方法、标准曲线的制备和精密度测定。本发明方法线性关系良好、准确度高、重现性好，可用于重组人内皮抑素注射液的血药浓度测定及药动学研究。

主权项

一种含组氨酸标签重组人内皮抑素的生物样品提取方法并建立其质谱定量方法，具体步骤如下：A、生物样品制备方法：将含金属Ni2+琼脂糖凝胶加入离心柱，冷冻离心机离心去除液体；加入平衡液离心冲洗两次；含重组蛋白血浆加入，4℃涡旋混匀20min，加入平衡液洗两次，加入杂质洗脱液，最后加入蛋白洗脱液洗脱目的蛋白；将提取后的蛋白洗脱液用离心超滤方法置换为消化缓冲液，再加入2μL胰蛋白酶溶液，涡旋混合，37℃孵育12小时得酶解样品，加入2μL酶解反应终止液和2μL内标溶液后用于质谱定量；B、LC‑MS/MS检测方法：色谱条件为：岛津SLC‑20A型液相色谱系统；色谱柱：安捷伦300SB‑C8柱，3.5μm，150mm×2.1mm；流动相：A：含体积百分比0.1％甲酸的水，B：乙腈，梯度洗脱；柱温40℃，流速：0.2mL/min；进样量10μL；质谱条件为：API 4000型三重四极杆串联质谱仪，配有电喷雾离子化源和Analyst 1.3数据处理软件；离子源：电喷雾离子化源；正离子方式检测；电喷雾电压为5500V；温度550℃；源内气体1：氮气压力40PSI；气体2：氮气压力60PSI；气帘气：氮气压力25PSI；DP：90V；CE：40V；扫描方式为多重反应监测；特异性肽段多重反应监测设定值，Q1：802.3，Q3：651.8；内标肽段多重反应监测设定值，Q1：816.9，Q3：666.4。