用于表达异二聚体糖蛋白激素的表达框、表达载体及制备方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于表达异二聚体糖蛋白激素的表达框、表达载体及其制备方法。本发明要解决的技术问题是为高效表达异二聚体重组蛋白提供新的选择。本发明解决技术问题的技术方案是提供一种用于表达双亚基重组蛋白的表达框，其结构为在启动子后可操作的连接有双亚基重组蛋白的各个亚基的编码序列，各个亚基的编码序列之间用内部核糖体进入位点序列IRES进行连接。本发明表达框能实现在同一宿主细胞内各亚基的同步和高效表达，使其更经济和更有效。

主权项

用于表达异二聚体糖蛋白激素重组蛋白的表达框，其特征在于其结构为在启动子后可操作的连接有双亚基糖蛋白激素的α亚基和β亚基的编码序列，各个亚基的编码序列之间用内部核糖体进入位点序列IRES 进行连接；所述可操作的连接，是指将基因编码序列连接于启动子后并由启动子控制其表达；所述的α亚基的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示；所述的β亚基的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示；所述的内部核糖体进入位点序列为SEQ ID No.6 所示；其制备方法为：从基因库中获得人FSHβ亚基的序列和α亚基的序列以及IRES基因序列，在基因水平上按β亚基——IRES——α亚基或α亚基——IRES——β亚基模型进行拼接，并在5端和3端分别设计BamH1和Xho1内切酶位点，进行优化和全基因合成；或者进行PCR拼接：从基因库中获得人FSHβ亚基和α亚基的序列以及IRES基因序列，分别进行基因合成，并用下列引物用重叠PCR进行并接，先以IRES为模板，用引物P1和P2进行PCR反应，反应体积为50μl，反应条件为94℃变性3min，再94℃变性30sec，55℃复性30sec，72℃延伸45sec，共30个循环，最后72℃延伸5min；凝胶电泳并回收DNA片段，再将回收片段按一定量与β亚基和α亚基片段混合进行PCR反应，反应体积为50μl，反应条件为94℃变性3min，再94℃变性30sec，55℃复性30sec，72℃延伸45sec，共10个循环；再补加引物P3和P4后继续进行PCR反应，反应条件为94℃变性3min，再94℃变性30sec，55℃复性30sec，72℃延伸45sec，共30个循环，最后72℃延伸5min；凝胶电泳回收DNA片段，并克隆于TA克隆载体，进行酶分析和测序分析；PCR拼接所使用的引物为：   P1(SEQ ID No.8):5’TGAAATGAAA GAATAAGCGG CCGCCC 3’；P2(SEQ ID No.9): 5’TTCTGTAGTA ATCCATGGTT GTGGCA 3’；P3(SEQ ID No.10):5’TGGATCCAGGATGAAGACACTCCAGT 3’；P4(SEQ ID No.11):5’GGCTCGAGTT AAGATTTGTG AT 3’。