硫化物醌氧化还原酶基因载体构建及其转基因工程乳酸菌菌株

摘要

本发明涉及硫化物醌氧化还原酶基因载体（pMG36e-SQR-Myc）构建及其转基因工程乳酸菌菌株,属于生物技术领域。选用pcDNA3.1-SQR-Myc真核表达质粒为最初原材料，将SQR-Myc基因片段，连接于pMG36e载体，电转化乳酸乳球菌MG1363并得到高效稳定表达。本发明选择乳酸菌是因为乳酸菌为益生菌类，可作为一种安全的微生态制剂直接饲喂动物，使之栖居于肠道内发挥正常生理作用，而SQR乳酸菌有望在动物肠道中发挥降解硫化物的功能，最终降低粪便中硫化物的排放。

主权项

硫化物醌氧化还原酶基因载体pMG36e‑SQR‑Myc，其构建方法包括： 1） pMG36e‑SQR‑Myc载体构建选用pcDNA3.1‑SQR‑Myc真核表达质粒为最初原材料，利用限制性内切酶KpnⅠ和 Xba I将SQR目的基因连同Myc标记基因SQR‑Myc从pcDNA3.1‑SQR‑Myc载体上酶切下来，回收SQR‑Myc基因片段，采用T4连接酶将其连接于pMG36e载体相应的酶切位点，构建成pMG36e‑SQR‑Myc原核表达载体；利用KCM转化法导入大肠杆菌DH5α中，在含有红霉素的LB培养基上筛选、鉴定出阳性转化子； 2） 含SQR基因的重组质粒阳性鉴定分别挑取阳性转化子白色菌落进行 PCR法和双酶切法鉴定：接种至LB培养基中培养，碱裂解法少量提取质粒，经双酶切鉴定目的基因SQR和标记基因Myc连接于pMG36e的相应位点；以质粒为模板，根据SQR基因序列设计引物P1、P2，鉴定阳性重组质粒，引物P1 TCGTCACCAAGGACCCGATGTAT，P2  TCACGGCCTTCAGCTTGTCG，反应条件为 94℃，预变性5min，94℃变性10s， 51℃退火30s，72℃延伸80s，共30个循环，72℃延伸10min，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，含有SQR基因的条带，大小为1179bp。