Cav-1稳定低表达的SMMC-7721细胞系及其构建方法

摘要

本发明公开一种Cav-1低表达的SMMC-7721KD细胞系的构建方法。具体采用Cav-1SiRNA干扰技术构建Cav-1稳定低表达的SMMC-7721KD细胞系。经过设计引物、扩增目的片段，构建Cav-1SiRNA重组质粒，进行质粒转染，然后对转染后的细胞进行博莱霉素筛选，传代，建立稳定低表达的SMMC-7721KD细胞系，最终获得阳性重组细胞系，能够沉默SMMC-7721细胞中Cav-1的表达80％左右，并且Cav-1稳定低表达。Cav-1稳定低表达的SMMC-7721细胞系可作为模型，进行Cav-1参与的一些肿瘤细胞的研究，Cav-1与肝癌的相关性及其机理研究。

主权项

Cav‑1稳定低表达的SMMC‑7721细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(a)设计对应Cav‑1基因的shRNA的两条单链DNA模板，其碱基序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；(b)构建含有上述碱基序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的psiRNA‑hHlzeo G2重组质粒；(c)利用如步骤(b)获得的重组质粒转染宿主细胞SMMC‑7721得到的重组细胞株；(d)将步骤(c)所得重组细胞株经过Zeocin筛选培养基培养，细胞24小时一次换液，四天传代1次，传至第七代时，Cav‑1稳定低表达，第八代细胞扩大培养，并冻存细胞，获得阳性克隆细胞系；其中，上述的Zeocin筛选培养基为RPMI‑1640培养基加10％新生牛血清，再加100ug/L Zeocin；(e)将步骤(d)筛选所得的阳性克隆细胞株利用Western Blotting方法和/或X射线照射联合平板克隆形成实验法检测。