主权项 |
一种利用PEG作为渗透调节剂的小孢子培养方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)取甘蓝型油菜的花序作为小孢子培养的供体植株;(2)从所述供体植株上取花蕾并灭菌,再将灭菌后的花蕾加入到NLN‑13液体培养基中,研磨成悬浮液,过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀,在所述沉淀中依次加入含PEG6000的NLN液体培养基、秋水仙碱溶液和活性炭混合液,得到小孢子混合悬浮液;所述的NLN‑13液体培养基,以1L计,组成为:NLN液体培养基1L,蔗糖130g,pH 5.6~6.2;所述含PEG6000的NLN液体培养基,以1L计,组成为:NLN液体培养基1L、蔗糖1~65g和62.5~250g PEG6000,pH 5.6~6.2;所述秋水仙碱溶液的质量百分浓度为0.3~0.8%;所述活性炭混合液,以1L计,组成为:NLN液体培养基1L,琼脂糖2~5g和活性炭8~15g;(3)将所述小孢子混合悬浮液在黑暗条件下于30~33℃恒温热激处理0~3天,后取出在黑暗条件下于22~28℃培养10~15天,直至肉眼可见时,在黑暗条件下于22~28℃摇动培养5~10天,得到子叶期胚状体;(4)将所述子叶期胚状体接种至分化培养基中,在每天12~18小时光照和22~28℃下培养,形成再生芽;其中,所述分化培养基,以1L计,组成为:MS液体培养基1L,脱落酸2~4mg,萘乙酸0.2~0.5mg,蔗糖25g,琼脂6.5~7.5g,pH5.6~6.0;(5)切取再生芽接种至生根培养基上,在每天12~18小时光照和22~28℃条件下进行生根培养,将根生长健壮的苗经炼苗和移栽到土壤中,得到再生植株,鉴定倍性;其中,所述生根培养基,以1L计,组成为:MS液体培养基1L,萘乙酸0.5~1mg,蔗糖25g,琼脂6.5~7.5g,pH5.6~6.0。 |