一种抗人重组组织因子单克隆抗体的制备方法

摘要

一种抗人重组组织因子单克隆抗体的制备方法，是利用原核表达后纯化获得的截断型人重组组织因子结合福氏佐剂免疫小鼠，取鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，选取HAT选择培养基选择性培养筛选，有限稀释法亚克隆培养后，利用ELISA法选择目的杂交瘤细胞，大量扩增并注入同系小鼠腹腔内制备腹水，得到效价良好，产量较高的抗人重组组织因子单克隆抗体。本发明方法制备得到的抗人重组组织因子单克隆抗体灵敏性高、特异性强，可用于人重组组织因子的免疫亲和纯化，还可用于抗凝药物和肿瘤治疗药物的研究开发。

主权项

一种抗人重组组织因子单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：1)选择免疫原：利用200510012414.7专利构建表达的缺失胞内区的截断型人重组组织因子rhTF243作为免疫原，该截断型人重组组织因子含有天然人组织因子跨膜部分和胞外部分的243个氨基酸残基；2)免疫：将免疫原稀释成不同浓度的稀释液，与福氏完全佐剂或福氏不完全佐剂乳化混合成不同免疫原浓度的乳化混合液，对小鼠进行基础免疫、加强免疫、二次加强免疫和融合前冲击免疫，其中：基础免疫：采用30μg～60μg rhTF243/ml乳化混合液对小鼠进行皮下多点注射免疫；加强免疫：两周后，采用15μg～30μg rhTF243/ml乳化混合液对小鼠进行腹腔注射免疫；二次加强免疫，加强免疫两周后，采用15μg～30μg rhTF243/ml乳化混合液对小鼠进行二次腹腔注射免疫；融合前冲击免疫：二次加强免疫一周后，采用25μg～50μg rhTF243/ml乳化混合液对小鼠进行腹腔注射冲击免疫；3)筛选免疫血清：采用酶联免疫吸附法筛选免疫鼠血清；4)细胞融合及克隆化：选取血清效价最高的鼠脾细胞，与骨髓瘤细胞进行体外融合，经多次亚克隆获得稳定分泌抗人重组组织因子的杂交瘤细胞株；5)制备腹水：将杂交瘤细胞株扩大培养后，选取14～22周龄BALB/c雌性经产小鼠作为实验动物，以0.5ml/只注射液体石蜡，接种杂交瘤细胞株于小鼠腹腔内生产腹水，其中，杂交瘤细胞株接种密度1×105～5×105个/ml，接种量0.5ml/只；6)收集腹水：接种杂交瘤细胞株10～12d后，将腹水迅速吸至细胞离心管中，3000rpm离心15min，得到抗人重组组织因子单克隆抗体。