一种恶性疟原虫HRPII蛋白单克隆抗体的制备方法

摘要

本发明涉及一种恶性疟原虫HRPII蛋白单克隆抗体的制备方法，以恶性疟原虫HRPII蛋白为靶抗原，分析选择A、B两个优势抗原表位；分别将A、B两个优势抗原表位重复后通过连续四个甘氨酸连接，形成重组蛋白C；采用大肠杆菌最嗜密码子，将重组蛋白C氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列；化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并在其上下游分别添加酶切位点BamHI和EcoRI；将上一步合成得到的核苷酸片段插入表达载体PET-28a(+)，构建重组蛋白C表达载体，并在大肠杆菌ER2566中诱导表达重组蛋白C；超声破菌并低温离心后，取溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱，洗脱得到纯化重组蛋白C；重组蛋白C多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，多轮筛选得到6株杂交瘤细胞株；纯化单抗并分别标记辣根过氧化物酶(HRP)，ELISA正交实验配定最佳单抗配对组合。

主权项

一种恶性疟原虫HRPII蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征是：(1)以恶性疟原虫HRPII蛋白为靶抗原，分析选择A、B两个抗原优势表位，其氨基酸具体序列如下：A：LeuAsnLeuAsnLysArgLeuLeuHisGluThrGlnAlaHisValAspAspAlaHisHisAlaHisH isValAlaAspAlaHisHisAlaHis、B：AspAlaArgHisAlaThrAspAlaHisHisAlaAlaAspAlaHisHisAlaThrAspAlaHis；(2)将恶性疟原虫HRPII蛋白A、B两个优势抗原表位序列分别重复后再通过连续四个甘氨酸连接，得到重组蛋白C氨基酸序列，其具体序列如下：LeuAsnLeuAsnLysArgLeuLeuHisGluThrGlnAlaHisValAspAspAlaHisHisAlaHisHis ValAlaAspAlaHisHisAlaHisLeuAsnLeuAsnLysArgLeuLeuHisGluThrGlnAlaHisValA spAspAlaHisHisAlaHisHisValAlaAspAlaHisHisAlaHisGlyGlyGlyGlyAspAlaArgHis AlaThrAspAlaHisHisAlaAlaAspAlaHisHisAlaThrAspAlaHisAspAlaArgHisAlaThrA spAlaHisHisAlaAlaAspAlaHisHisAlaThrAspAlaHis；(3)采用大肠杆菌最嗜密码子，在重组蛋白C氨基酸序列不变的前提下，将重组蛋白C氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，具体的核苷酸序列如下：CTGAACCTGAACAAACGCCTGCTGCATGAAACCCAGGCCCATGTGGATGAT GCCCATCATGCCCATCATGTGGCCGATGCCCATCATGCCCATCTGAACCTGA ACAAACGCCTGCTGCATGAAACCCAGGCCCATGTGGATGATGCCCATCATG CCCATCATGTGGCCGATGCCCATCATGCCCATGGCGGCGGCGGCGATGCCC GCCATGCCACCGATGCCCATCATGCCGCCGATGCCCATCATGCCACCGATGC CCATGATGCCCGCCATGCCACCGATGCCCATCATGCCGCCGATGCCCATCAT GCCACCGATGCCCAT；(4)化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并在其上下游分别添加酶切位点BamHI和EcoRI对应的核苷酸序列，具体序列分别是GGATCC和GAATTC，通过酶切连接，将上一步合成得到的核苷酸片段插入表达载体PET‑28a(+)，构建重组蛋白C表达载体；(5)重组蛋白C表达载体转化大肠杆菌ER2566感受态细胞，筛选得到重组蛋白C表达菌株；(6)重组蛋白C表达菌株大规模培养后，超声破菌并低温离心，取溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱，洗脱得到纯化重组蛋白C；(7)重组蛋白C多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，经过多轮筛选最终得到6株杂交瘤细胞株；(8)纯化单抗。