利用转录因子转染牛体细胞成为诱导性多能干细胞的方法

摘要

本发明公开了一种利用转录因子转染牛体细胞产生诱导多能干细胞(iPSCs)的方法，具体包括下列步骤：1)牛皮肤成纤维细胞的分离与培养；2)牛维持多能性转录因子基因的克隆及其逆转录病毒载体的构建；3)逆转录病毒的包装与准备；4)逆转录病毒感染牛皮肤成纤维细胞以及牛的诱导性多能干细胞的获得。本发明首次采用脱细胞后人羊膜作为支持物代替小鼠胚胎成纤维细胞来维持牛iPSCs体外增殖并长期保持未分化的多能性状态。这种采用基因诱导产生多能性干细胞的方法，不但解决了动物特别是如牛、羊、猪等家畜多能性干细胞难以获得的技术难题，而且避免了应用鼠胚胎成纤维细胞作为干细胞的饲养层所带来的异种动物细胞污染问题。

主权项

一种利用转录因子转染牛体细胞成为诱导性多能干细胞的方法，包括如下步骤：1)牛皮肤成纤维细胞的分离与培养以成年牛皮肤成纤维细胞BDFs和新生牛皮肤成纤维细胞NDFs，经常规培养后分别获得大量的成年牛皮肤细胞和新生牛皮肤成纤维细胞；2)牛维持多能性转录因子基因的克隆及其逆转录病毒载体的构建由来源于50‑60日龄牛胎儿生殖嵴的总RNA，经过逆转录反应得到cDNA；以cDNA为模板，经过PCR反应得到牛Oct4、Sox2、Nanog和Lin28四个基因扩增产物并经测序验证序列正确而后将目的基因插入到逆转录病毒载体pMSCVneo中，构建这4种基因的逆转录病毒表达载体；3)逆转录病毒的包装与准备PT67包装细胞按照常规方法培养在DMEM培养基中，待细胞达到70％‑80％汇合时，应用脂质体将4种逆转录病毒载体分别转染进入包装细胞PT67细胞，进行病毒包装以获得具有感染性逆转录病毒颗粒；转染前1小时，DMEM培养基换成无血清培养液，4‑8μg逆转录病毒质粒DNA和10‑20μl脂质体分别加入到2份500μl Opti‑MEM‑I+GlutaMAX‑I优化转染液中，轻柔混匀，室温孵育，然后将稀释的质粒DNA和脂质体轻柔混匀，再室温孵育；20分钟后，将混合液逐滴加入PT67细胞培养皿中；细胞在37℃，5％CO2和饱和湿度条件下培养4‑6h，之后，转染液换成新的含15％FBS的DMEM培养液；经过24小时转染后，收集PT67细胞培养液上清，该上清中就包含感染性逆转录病毒颗粒；上清液经过0.45μm孔径的滤膜过滤；每24小时收集一次，连续收集3 天；病毒悬浮液在4℃下，经过25,000转/分，离心90分钟，10倍浓缩病毒上清液，‑80℃保存；将Oct4、Sox2、Nanog和Lin28四种基因病毒上清液进行等量混合，并添加8μg/ml polybrene，准备转染牛皮肤成纤维细胞；4)逆转录病毒感染牛皮肤成纤维细胞以及牛的iPS细胞的获得将成年牛皮肤成纤维细胞BDFs和新生公牛皮肤成纤维细胞NDFs按照常规方法培养在60mm塑料培养皿中，待培养皿中细胞生长到70‑80％融合时将包含Oct4、Sox2、Nanog和Lin28基因转录因子的逆转录病毒上清液的混合液分别加入到成纤维细胞BDFs与NDFs培养皿中感染成纤维细胞；细胞长满培养皿后按1∶3常规传代，视细胞生长情况在第6‑10天将细胞以1×105细胞/孔的密度，转移至预先铺有人羊膜6孔培养板上，用人羊膜代替小鼠胚胎成纤维细胞MEF作为饲养层培养感染后的牛细胞，同时培养液更换成干细胞培养液；培养孔内每天半量换液，连续观察20‑28天，直到有细胞集落出现为止，记为0代，即为牛iPSCs；所述的干细胞培养液的组成为：每100ml溶液中含有：82.69ml的knockout‑DMEM、15ml FBS、1ml浓度为200mM谷氨酰胺、1ml浓度为10mM非必需氨基酸、200μl浓度为55mM β‑巯基乙醇、10μl浓度为400ng/ml人重组碱性成纤维生长因子、100μl浓度为105U/ml白血病抑制因子。