一种桔霉素-蛋白偶联抗原的双交联化学合成法及其抗桔霉素单克隆抗体的制备方法

摘要

本发明涉及了一种桔霉素-蛋白偶联抗原的双交联化学合成法及其抗桔霉素单克隆抗体的制备方法，属于生物技术领域。该方法用桔霉素先与双交联试剂(C2H3O)-(CH2)n-(C2H3O)进行反应，然后与载体进行偶联，反应后用甘氨酸进行封闭，最后经分离纯化得到桔霉素载体偶联抗原。应用杂交瘤细胞技术进行细胞融合和筛选，获得稳定分泌的抗桔霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，通过制备腹水和纯化，获得抗桔霉素的单克隆抗体。本发明制备条件温和、操作简且过程可控，所获得的抗桔霉素单克隆抗体特异性高、亲和力强，可用于进一步制备桔霉素检测的酶联免疫检测试剂盒或试纸卡。

主权项

一种桔霉素‑蛋白偶联抗原的双交联化学合成方法，其特征在于桔霉素先与双交联试剂 (C2H3O)‑(CH2)n‑(C2H3O)反应，然后与大分子载体进行偶联，反应后用甘氨酸封闭，最后经分离纯化得到桔霉素‑载体偶联抗原；具体包括以下步骤：（1）桔霉素的活化：将0.5～10mg桔霉素溶解于0.5～10ml的0.6mol/l氢氧化钠溶液中，加入0.5～10ml的2mg/ml硼氢化钠溶液，摇匀后，再加入0.5～10μl的双交联试剂，室温下反应4～10小时；所述的双交联试剂为1,4‑丁二醇二缩水甘油醚；（2）桔霉素‑载体偶联反应：加入30～600mg碳酸钠，调节pH9.0～11.0，然后按桔霉素与载体初始摩尔比为10/1～1000/1加入载体，混匀完全后，置于37℃振摇反应，反应24～48小时；（3）甘氨酸封闭：偶联反应后，加入100～2000mg甘氨酸进行封闭，置于37℃振摇反应，反应24～48小时；（4）分离纯化：将反应液取出，采用G‑25凝胶柱洗脱或透析，收集洗脱液或透析袋内溶液，进行紫外全波长扫描，检测278nm和319nm波长的吸收值，计算偶联比，并将偶联物冷冻干燥后‑20℃保存。