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一种土壤微生物基因组DNA和总RNA的提取方法，包括土壤样品杂质的去除，土壤微生物细胞裂解、核酸游离及沉淀，其特征在于：所述方法具体包括以下步骤：（1）土壤样品杂质的去除：称取0.2～1.0g的新鲜作物根际土壤样品于2ml的无菌离心管中，加入40～200μl 1M pH=5.5的Tris‑HCl、V1 μl无菌双蒸水和V2 μl 0.2M Al2(SO4)3水溶液，其中V1=900μl‑V2、V2=60～300μl，涡旋震荡30s；然后加入1/3 V2体积4M NaOH溶液，以及V3体积0.1M pH=8的Tris‑HCl，其中V3=1300‑ 4/3 V2‑ V1，涡旋震荡30s，用4M NaOH溶液调节土壤溶液的pH值≥8，3500rpm离心2min，用移液枪移去上清并计算上清体积V4；（2）土壤微生物细胞裂解：在步骤（1）离心得到的沉淀中加入V5体积的0.1M pH=8的Tris‑HCl ，其中V5= V4‑650μl，再加入0.5～0.8g 0.5mm玻璃珠，0.3～0.5g 0.1mm玻璃珠和1～2个4mm玻璃珠，然后再加入325μl 10% pH=8的SDS水溶液、325μl pH=8的EB溶液，涡旋震荡30s、冰浴1min，然后再涡旋震荡1min、冰浴5min，再次涡旋震荡1min，然后4℃ 11000rpm 离心1min，取上清备用；（3）核酸游离及沉淀：取600～800μl步骤（2）得到的上清至1.5ml无菌离心管，加入与上清等体积的酚、氯仿和异戊醇混合液，其中酚：氯仿：异戊醇体积比=25:24:1，涡旋震荡，冰浴5min，期间每分钟震荡1次，最后4℃ 16000rpm离心15min；将离心后的上清转移至1.5ml离心管，加入与上清等体积的氯仿和异戊醇混合液，其中氯仿：异戊醇体积比=24:1，涡旋震荡，4℃ 16000rpm 离心15min，取上清；将上清转移至新的1.5ml离心管，加入与上清等体积的氯仿和异戊醇混合液，其中氯仿：异戊醇体积比=24:1，涡旋震荡，4℃ 16000rpm 离心15min，取上清；将上清转移至另一个1.5ml离心管，加入0.7倍上清体积的异丙醇和0.1倍上清体积3M pH=5.5的醋酸钠，4℃静置3h或‑20℃沉淀10min，然后4℃ 18000rpm 离心60min；去除上清，沉淀用5ml 75%乙醇在4℃温度下洗涤两次，然后 18000rpm 离心5min；去除上清，沉淀于无菌操作台中吹干并用30μl 0.1%DEPC水溶解，得到含有DNA和总RNA的溶液，‑80℃保存；步骤（2）所述EB溶液的配制为：称取2.416g LiCl、1.211g Tris、3.506g EDTA，加入双蒸水溶解并用4M NaOH溶液调节pH=8.0，定容至100ml；步骤（3）所述75%乙醇用0.1%DEPC水配制。 |
