一种含利钠肽基因的药物及制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种重组质粒，含有如SEQ ID NO.1的核苷酸序列。本发明还提供了一种药物组合物，它含有所述的重组质粒。本发明还提供了该药物组合物的制备方法和用途。本发明是采用基因治疗的途径，即将利钠肽基因慢病毒表达载体导入大鼠玻璃体腔，观察到目的基因的表达高，有明显的降低活体动物眼压的效果，并且不良反应少，成本低廉，效果肯定，为青光眼治疗开创新的思路。

主权项

1.一种重组质粒，其特征是：它是由如下方法制备的：（1）以如下引物对为引物，以Norway大鼠肾脏组织总RNA为模板，扩增利钠肽基因片段；上游引物：5’-AGGATCCATCGGCACCATGCA-3’下游引物：5’-GGAATTCGCTGCACTAACATC-3’其中，Norway大鼠肾脏组织总RNA的提取如下：将该步骤所使用的器材预先用0.1%的DEPC水处理，再按照Invitrogen公司TRIZOL®Reagent操作说明进行：1）取新鲜正常Norway大鼠肾脏组织约100mg，剪碎后迅速加入液氮研磨；2）加入1mlTRIZOL，继续研磨，直到组织完全破碎；3）将上述组织的TRIZOL裂解液转入EP管中，在室温下放置5min；4）在上述EP管中，加入0.2ml氯仿，盖上EP管盖子，用力震荡15sec，室温放置3min后，4℃下12,000g离心15min；5）取上层水相置于新EP管中，再加入0.5ml异丙醇，室温放置10min,4℃下12,000g离心10min；6）弃上清，加1ml75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，4℃下7,500g离心5min，弃上清；7）让沉淀的RNA在室温下自然干燥；8）用100μl不含RNA酶的水溶解RNA沉淀，分装后置-80℃冰箱保存备用；（2）以限制性内切酶BamHI和EcoRⅠ双酶切pCDF1-MCS2-EF1-copGFP空载体和步骤（1）扩增的利钠肽基因片段，用T4DNA连接酶连接，构建表达质粒；（3）将脂质体Lipofectamine2000介导的pPACKF1®PackagingPlasmidMix和表达质粒共同转染293FT细胞，包装病毒，293FT细胞转染后48及72h，收获培养基上清，经离心过滤，去除细胞碎片，然后进行超速离心，将沉淀用PBS重悬，即收获了浓缩的含重组质粒的慢病毒。