一种基于抗菌肽的双功能融合蛋白及其制备方法和用途

摘要

本发明公开了一种基于抗菌肽的双功能融合蛋白及其制备方法和用途，所述的基于抗菌肽的双功能融合蛋白，是基于天蚕素B蛋白序列和人表皮生长因子的融合蛋白，并将其连接蛋白特别设计为凝血酶能够识别的位点，并且在融合蛋白上构建纯化的His标签。本发明对于上述融合蛋白采用原核表达系统来实现其生物制备，并获得了纯化的融合蛋白。利用纯化的融合蛋白进行了抑菌试验和活体动物实现验证，表明该融合蛋白能够应用于制备治疗表皮创伤的药物，用于表皮的创伤、擦伤、烧伤、烫伤等疾病，并可防止伤口的感染。

主权项

一种基于抗菌肽的双功能融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)构建包含SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重组原核表达载体；2)将构建好的重组原核表达载体转染宿主细胞Rosetta‑gamiTM2(DE3)，筛选出阳性克隆的重组细胞，并对其进行增殖培养；当菌体浓度达到A600为0.3～0.6时，用终浓度为0.1～1mmol/L的IPTG诱导3～5h，离心收集重组细胞；3)双功能融合蛋白的纯化：将重组细胞裂解后离心分离得到沉淀，将其溶解于上样缓冲液中，4℃溶解过夜；所述的上样缓冲液为：8mol/L尿素、10mmol/L Tris和0.1mol/L NaCl，pH7.0；过夜后离心弃沉淀，保留上清得到双功能融合蛋白的包涵体溶解上清；对包涵体溶解上清进行镍离子亲和层析柱分离纯化，以咪唑梯度溶液洗脱层析柱得到包含双功能融合蛋白的洗脱峰；调整收集的洗脱峰的双功能融合蛋白浓度至0.1～0.2g/L，加入β‑巯基乙醇至终浓度为10～20mmol/L，然后用复性缓冲液I、复性缓冲液II和复性缓冲液III依次进行透析复性，最终离心收集得到包含复性的双功能融合蛋白的上清；所述的复性缓冲液I为：2mol/L尿素、10mmol/L Tris和5mmol/L β‑巯基乙醇，pH7.0；复性缓冲液II为：10mmol/L Tris和5mmol/L β‑巯基乙醇，pH7.0；复性缓冲液III为：PBS缓冲液，pH7.0。